許子志 王川 許東興 蔡秀鶯

·論著·

分化和DNA結(jié)合抑制因子1基因?qū)DA-MB-231乳腺癌細胞株MMP9表達的影響

許子志 王川 許東興 蔡秀鶯

目的篩選成功轉(zhuǎn)染Id1 miRNA真核表達載體乳腺癌MDA-MB-231細胞系，觀察對乳腺癌細胞的對Id1、MMP9表達的影響。方法構(gòu)建Id1 miRNA真核表達載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細胞株以殺稻瘟霉素篩選穩(wěn)定表達的細胞株。經(jīng)RT-PCR方法鑒定其對Id1、MMP9表達的影響。結(jié)果經(jīng)過篩選，獲得轉(zhuǎn)染Id1 miRNA真核表達載體穩(wěn)定表達的MDA-MB-231細胞系。經(jīng)RT-PCR方法鑒定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Id1 miRNA真核表達載體的乳腺癌MDA-MB-231細胞株其Id1、MMP9表達水平低于對照組，且Id1、MMP9表達水平正相關(guān)。未轉(zhuǎn)染組與陰性對照轉(zhuǎn)染組無明顯差異。結(jié)論本實驗成功篩選出穩(wěn)定表達Id1 miRNA的乳腺癌細胞株，證實Id1 miRNA真核表達載體構(gòu)建成功干擾有效，并且Id1與mmp9表達相關(guān)，為將來進一步研究他們之間的生物學(xué)行為差異，或詳細了解其分子作用機制奠定了基礎(chǔ)。

Id1；MMP9；真核表達載體；乳腺癌細胞株

Id1(Inhibition of DNA binding/differentiation)蛋白是一組缺乏堿性DNA連接結(jié)構(gòu)域的HLH因子。被認(rèn)為是分化和DNA結(jié)合的抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)Id家族的蛋白在許多腫瘤中的表達是上調(diào)的[1-4]，研究證實其參與腫瘤的發(fā)生，與腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化、生長、浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)[4]。本實驗室曾報道Id1與細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子表達的關(guān)系[5]。本研究旨在探討Id1基因與MMP9表達的關(guān)系，初步探討Id1影響乳腺癌惡性生物學(xué)行為的機制。

1 資料與方法

乳腺癌細胞MDA-MB-232細胞株。大觀霉素。Sc734-Id1單抗(兔源)，MMP9單抗(兔源)。lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒。殺稻瘟霉素。RT試劑盒A3500。Id1 miRNA干擾序列及陰性對照序列，質(zhì)粒等[6]。

1.1乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞的培養(yǎng)與傳代確定殺稻瘟霉素篩選濃度為：6ng/L。

1.2以Lipofectamine2000及各重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞株及以6ng/L殺稻瘟霉素穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選[6]。

1.3RT-PCR法檢測Id1 MMP9 mRNA表達。

1.4免疫細胞化學(xué)方法檢測Id1蛋白、MMP9蛋白表達：以MMP9(1 ∶ 100)和Id1(1 ∶ 300)單克隆抗體檢測、對比轉(zhuǎn)染前后MDA-MB-231細胞株中MMP9及Id1蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1在重組質(zhì)粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達載體的細胞克隆中，重組的目的基因包含Id1 miRNA序列。結(jié)果證實兩組轉(zhuǎn)染載體的細胞克隆中Id1表達與其他組不相同。穩(wěn)定表達重組質(zhì)粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表達載體B，C的兩組細胞克隆中Id1RNA的表達水平降低；整合negative control陰性對照載體的細胞克隆D組中Id1RNA的表達水平與無轉(zhuǎn)染A組相似(見圖1)。

2.2實驗結(jié)果證實轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表達載體的細胞C組克隆中MMP9表達水平降低；整合negative control陰性對照載體的細胞克隆B組中Id1RNA的表達水平與無轉(zhuǎn)染A組相似。

2.3轉(zhuǎn)染前后Id1 1 ∶ 300稀釋度下在胞漿可見程度不同陽性表達，PBS陰性對照僅見核被蘇木素染色。在重組質(zhì)粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達載體的細胞克隆中，重組的目的基因包含Id1 miRNA序列。結(jié)果證實轉(zhuǎn)染載體的細胞克隆中Id1表達明顯減弱(見圖3、4、5、6)。

2.4轉(zhuǎn)染前后MMP9 1 ∶ 100稀釋度下在胞漿可見程度不同陽性表達，在重組質(zhì)粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達載體的細胞克隆中，重組的目的基因包含Id1 miRNA序列。結(jié)果證實轉(zhuǎn)染載體的細胞克隆中MMP9表達明顯減弱。(見圖5、6)

圖1 各實驗組Id1 PCR圖

A.無轉(zhuǎn)染組B.轉(zhuǎn)染No.2真核表達質(zhì)粒組C.轉(zhuǎn)染No.3真核表達質(zhì)粒組D. 轉(zhuǎn)染negative control陰性對照組 M:Marker

圖2各實驗組MMP9 PCR圖

A.無轉(zhuǎn)染組B. 轉(zhuǎn)染negative control陰性對照質(zhì)粒組C.轉(zhuǎn)染真核表達質(zhì)粒組M:Marker

圖3MDA-MB-231乳腺癌細胞1 d 1免疫化學(xué)表達(1 ∶ 300)×400

圖4轉(zhuǎn)染(C組)后MDA-MB-231乳腺癌細胞1 d 1免疫化學(xué)表達(1 ∶ 300)×400

圖5MDA-MB-231乳腺癌細胞MMP9免疫化學(xué)表達(1 ∶ 100)×400

圖6轉(zhuǎn)染(C組)后MDA-MB-231乳腺癌細胞MMP9免疫化學(xué)表達(1 ∶ 100)×400

3 討論

乳腺癌的浸潤，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致許多女性死亡的重要原因。Id1過度表達與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。Id1蛋白可以通過多條途徑影響CyclinD1的表達，推動細胞周期由G1期進入S期，通過MAPK途徑促使下游早期生長反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的增加，促進細胞增殖[7]。致細胞侵襲性和遷移性增加，使其通過基底膜的侵襲力大大提高，Id1可能通過影響乳腺組織基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，促進乳腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等。[8]

MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族一員。參與腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程。通過對腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的機制研究發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)(ECM)在腫瘤的的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵的作用[9]。腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力與其誘導(dǎo)產(chǎn)生降解ECM、基底膜的蛋白酶的能力密切相關(guān)，腫瘤細胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶能夠降解ECM，從而促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[10]。

本研究通過構(gòu)建miRNA真核表達載體，轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺癌細胞株，成功抑制Id1基因表達。研究同時發(fā)現(xiàn)其也可以抑制MMP9的高表達，提示Id1與MMP9之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，MMP9可能是Id1作用通路中的下游因子，其功能的實現(xiàn)可能受到Id1的調(diào)節(jié)。Id1可能通過影響MMP9表達促進腫瘤細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。另腫瘤的發(fā)生，發(fā)展及侵襲過程必然伴隨著新生血管的生成， VEGF被認(rèn)為是最主要，最特異性的一種內(nèi)皮細胞生長因子。本實驗室既往研究證實Id1與乳腺癌增殖及血管生成的行為有關(guān)[5]。綜合提示Id1可能通過調(diào)節(jié)MMP9、VEGF等下游因子推動細胞周期參與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，侵襲，轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，Id1基因與乳腺癌細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為存在密切的關(guān)系，這可能是導(dǎo)致乳腺癌預(yù)后不良的生物學(xué)基礎(chǔ)，其詳細的機制值得進一步深入探究。我們設(shè)想通過抑制Id1的表達可以相應(yīng)的降低腫瘤的惡性程度，抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，可能為乳腺癌的治療開辟了一個新途徑。

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RelationshipbetweenId1geneexpressionandMMP9inMDA-MB-231breastcancercellline

XUZi-zhi,WANGChuan,FUFang-meng,etal.

TheUnionHospitalAffiliatedofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China

ObjectiveTo select the the stabilized expressed cells lines of miRNA eukaryotic expression vector of Id1. To explore the relationship between Id1 and MMP9 expression in breast cancer line MDA-MB-231.MethodsUse Blasticidin to select stabilized expressed cell lines of miRNA eukaryotic expression vector of Id1.the level of Id1 and MMP9 was detected using RT-PCR methods.ResultsThe stabilized expressed cell lines through 2W Blasticidin selection. As a result of RT-PCR identification, the level of Id1 and MMP9 in Id1 miRNA transfeced cell line is lower than that in the control groups. While there is no difference between the not transfected and negative control transfected cell line.

Id1;MMP9;Eukaryotic expression vector;Breast cancer

351100 福建省莆田市第一醫(yī)院乳腺甲狀腺外科(許子志 許東興);福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺外科(王川);福建省莆田市涵江醫(yī)院婦產(chǎn)科(蔡秀鶯)

許子志 E-mail：xuzizhi20022002@yahoo.com.cn