北京市懷柔區(qū)第一醫(yī)院（101400）寧涓

造血干細胞移植（HSCT）尤其是異基因HSCT（allo-HSCT）現廣泛應用于血液腫瘤或非血液惡性腫瘤、再生障礙性貧血、某些遺傳性疾病等的治療，甚至認為allo-HSCT是治愈某些血液腫瘤和遺傳性疾病的唯一方法。目前，移植物抗宿主?。℅VHD）仍是allo-HSCT移植后相關死亡的主要原因，是移植的首要障礙，即使在接受HLA配型完全相合的同胞供者移植的患者中，也常發(fā)生嚴重的急性移植物抗宿主?。╝GVHD）而致死。因此，利用動物型模來研究aGVHD的發(fā)病機理，具有十分重要的理論和實用價值。因此，我院利用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠來建立一種穩(wěn)定可靠的同種異基因骨髓移植（BMT）aGVHD模型，以便更好的研究aGVHD的發(fā)病機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ①清潔級雌性BALB/c（H-2d）小鼠36只，6～8w，18～22g；②清潔級雄性BALB/c（H-2d）小鼠24只，6～8w，18～22g；③清潔級雄性C57BL/6（H-2b）小鼠24只，6～8w，18～22g；均購自首都醫(yī)科大學實驗動物中心，并在首都醫(yī)科大學實驗動物中心層流房中飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及其配置 含抗生素的飲用水（紅霉素250mg/L，慶大霉素32×104U/L，氟哌酸200mg/L），PBS緩沖液（NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g溶解后加三蒸水至1L，調pH 7.2，4℃保存），RPMI-1640培養(yǎng)液（GIBCO公司），紅細胞裂解液（Tris 2.6g、NH4Cl 7.47g溶于1L三蒸水中，0.22μm濾膜過濾除菌，調pH 7.2，4℃保存），PCR引物合成（英駿生物技術有限公司），普通PCR試劑盒（深圳中晶生物技術有限公司），瓊脂糖粉（sigma公司），DNA Marker（上海申能博采公司），3S Spin Genomic DNA Miniprep Kit V3.0（上海申能博采公司）。

1.1.3 實驗儀器 普通離心機：LD-2A型（北京醫(yī)用離心機廠制造），低溫高速臺式離心機（Universal 32，德國），PTC-0200型PCR儀（美國），恒溫恒壓電泳儀（國產），YH-1型超凈工作臺（廣州），Olympus倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），X線直線加速器-231型（VARIAN公司，美國），凝膠圖像光密度分析儀UVP-GDS型（英國），紫外分光光度計GeneQuant Ⅱ（Pharmacia Biotech公司，英國），200目不銹鋼篩網（廣州），微量加樣器（0.5-1000μL，Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 受鼠準備 移植前1w將BALB/c（H-2d）小鼠置于空氣層流房的動物飼養(yǎng)空氣層流柜中無菌飼養(yǎng)，所有墊料、飼料及飲用水均經高壓滅菌處理，移植前5d接受含抗生素的飲用水直至移植后2w。

1.2.2 預處理 移植4h前BALB/c（H-2d）小鼠接受全身照射（TBI），總劑量為8.0Gy，劑量率為0.5Gy/min，照射源與動物之間間隔90cm。

1.2.3 造血干細胞和淋巴細胞移植

1.2.3.1 供鼠骨髓單個核細胞分離 ①斷頸處死供鼠，75%酒精浸泡5min，在超凈臺內將小鼠腹部向上平放，在腹區(qū)下部皮膚上做一長橫切口，剝開皮膚，露出臀部及后肢。②用鼠齒鑷拉緊后肢，用剪刀盡可能將肌肉剪開，在髖關節(jié)處將后肢與軀干分離，分離時勿傷長骨骨骺，取下的后肢放入有RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。③用剪刀盡可能去除股骨及脛骨表面黏附的肌肉，將脛骨、股骨放入RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中浸泡5min，更換器械，嚴格無菌操作；然后剪開兩端的骨骺，用1mL注射器針頭刺入骨髓腔中。④用裝有RPMI-1640培養(yǎng)液的注射器反復沖洗骨髓腔，沖洗液裝入10mL無菌離心管，用吸管反復吹打，靜置片刻，去除試管底部沉淀；用紅細胞裂解液裂解紅細胞；之后離心，去除上清液（1500rpm，5min），加RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，再加入RPMI-1640液培養(yǎng)液2mL，反復吹打使細胞充分混勻，隨后在顯微鏡下計數有核細胞的數量，最后用RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×108/mL，備用。

附表1 小鼠分組

附表2 各組小鼠平均存活時間

1.2.3.2 供鼠淋巴細胞懸液的制備 ①在供鼠腹區(qū)沿腹部中線做一縱切口，打開腹腔，取下脾臟（盡量剔除脂肪組織），置于預先加入5mL RPMI-1640培養(yǎng)液的無菌平皿中。②在平皿中用注射器針芯在無菌200目不銹鋼篩網上輕輕研磨脾臟，并用移液管吸取RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗不銹鋼篩網，沖洗2遍，移至10mL刻度離心管，以1000rpm（常規(guī)臺式離心機）離心10min，加入5mL預冷的紅細胞裂解液，混勻，靜置6min，加入RPMI-1640培養(yǎng)液5mL中止裂解液裂解，1000rpm離心10min，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2遍，以RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為3×108/mL，備用。③將上述兩種細胞懸液等體積混合，此時脾細胞濃度為1.5×108/mL，骨髓細胞濃度為0.5×108/mL，小鼠移植前4h行X射線全身照射（TBI 8.0Gy，計量率0.5Gy/min），在無菌條件下用1mL注射器沿受鼠尾靜脈輸注供鼠骨髓細胞和淋巴細胞混合懸液0.2mL，此時脾細胞數為3×107，骨髓細胞數為1×107。

1.2.4 小鼠分組及造血干細胞和淋巴細胞移植見附表1。

附圖1 各組小鼠肝臟表現

1.2.5 結果判斷標準

1.2.5.1 移植植活狀態(tài)好 體重增加，脾臟見到明顯的脾結節(jié)，外周血WBC＞1.0×109/L，PCR可檢測出Y染色體。

1.2.5.2 移植失敗 照射后很快死亡，死亡時外周血WBC＜0.5×109/L，沒有嵌合體形成。

1.2.5.3 感染 外周血WBC＞0.5×109/L，外周血見中性粒細胞核左移，胞漿中有中毒顆粒。

1.2.5.4 aGVHD的判斷標準 外周血WBC＞1.0×109/L，且伴有倦怠，精神萎靡，嗜睡，食欲下降，體重下降，弓背，脫毛，腹瀉，出血；病理檢查可見肝臟、脾臟組織淋巴細胞浸潤，正常組織結構破壞。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 所有數據均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行處理，小鼠造血重建時間采用獨立樣本t檢驗，受鼠生存時間采用K Independent Samples Test分析。

2 結果

2.1 造血重建 本研究動態(tài)觀察結果表明，預處理后第3d三組受鼠WBC＜1×109/L，且單純照射組WBC始終＜1×109/L，同基因組和異基因組WBC＞1.0×109/L的時間分別為9.33±2.31d、10.33±1.65d（P＝0.501），兩組造血重建時間差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 小鼠一般狀況和aGVHD觀察 三組小鼠照射后前6d變化類似：體重進行性下降，伴活動減少，嗜睡，皺毛，弓背但無腹瀉。A組小鼠于第6d開始死亡，死亡高峰在移植后9～12d，第12d全部死亡；B組小鼠第7d起體重逐漸增加，至移植后3w時體重恢復正常并繼續(xù)增加，該組小鼠未出現aGVHD的癥狀，全部存活時間＞60d；C組小鼠第7～10d體重略回升，11d后體重再度開始下降，并在11d左右再次出現活動減少，嗜睡，弓背，脫毛，腹瀉等典型GVHD表現[1]，死亡高峰在移植后15～17d，第17d全部死亡，三組小鼠生存時間存在顯著性差異（P＜0.01）。各組小鼠移植后平均存活時間見附表2。

2.3 GVHD發(fā)生率 A組、B組小鼠未發(fā)生aGVHD，C組小鼠全部出現aGVHD表現，發(fā)生率100%。

2.4 生存期觀察 經統(tǒng)計學分析，A、B、C三組小鼠間的生存時間存在顯著差異（Log rank＝28.025，P＝0.000）。

2.5 移植后各組小鼠肝臟、脾臟的GVHD相關病理形態(tài)學改變 對各組小鼠的肝臟、脾臟標本作常規(guī)病理切片結果顯示：三組小鼠肝臟、脾臟第3d、第7d未見病變；單純照射組小鼠第12d（瀕死前）肝臟病變：肝臟部分肝細胞輕度水腫，出現空泡；脾臟髓質脾小體明顯消失，大量紅細胞壞死，含鐵血黃素沉積。同基因骨髓移植組小鼠肝臟第14d病理學檢查未見異常；脾臟可見脾小體縮小，髓質淋巴細胞未減少，纖維組織增生。異基因骨髓移植組小鼠第14d（發(fā)生aGVHD后3d）肝臟病變：肝臟出現肝細胞點狀壞死，嗜酸性變，匯管區(qū)淋巴細胞浸潤；脾臟髓質脾小體消失，脾竇擴張、淤血、纖維組織增生，組織細胞增生典型，見附圖1和2。

2.6 PCR法特異性擴增Y染色體進行嵌合體檢測 移植后生存時間＞10d的所有小鼠（BALB/c，♀）進行PCR法擴增外周血Y染色體檢查，全部均檢查到Y染色體，提示供鼠（C57BL/6，♂）骨髓細胞植入成功。

3 討論

HSCT廣泛用于惡性與非惡性疾病的治療，尤其是allo-HSCT被認為是治愈某些疾病的唯一方法。移植發(fā)展至今，盡管在許多方向獲得極大發(fā)展，但影響allo-HSCT預后的最主要并發(fā)癥GVHD仍未得到很好解決。同種異體HSCT后GVHD的發(fā)生率高達50%～80%，并造成30%的移植相關死亡率，嚴重影響移植后患者的生存時間和生存質量[2]。因此，需要建立一種穩(wěn)定可靠的GVHD動物模型以便更好地研究防治GVHD的方法具有十分重要的意義。鑒于此，筆者利用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠來建立一種穩(wěn)定可靠的同種異基因骨髓移植（BMT）aGVHD模型。

附圖2 各組小鼠脾臟病理特點

GVHD主要是由T細胞介導的免疫反應，是由供者來源的T細胞識別受者的主要組織相容性和/或次要組織相容性抗原從而被活化，通過釋放炎癥細胞因子和直接殺傷作用，損傷受者組織器官的免疫病理過程[3][4][5][6]。眾多因素與GVHD的發(fā)生有關，其中移植物中免疫活性細胞的數量、供受者之間的組織相容性抗原不合和宿主缺乏對移植物發(fā)動免疫攻擊能力是GVHD發(fā)生的3個必備條件。在小鼠aGVHD動物模型中為滿足上述3個條件，筆者對小鼠進行骨髓移植前預處理，移植前4h利用X射線全身照射（total body irradiation，TBI），總劑量8.0Gy，劑量率為0.5Gy/min，照射的目的是清除受者的骨髓造血組織并抑制受者的免疫功能。目前研究認為，GVHD的效應是供體的活化淋巴細胞，有文獻報道當移植的脾細胞＞1×107個時，方可造成典型的aGVHD的征象，骨髓細胞必須＞1×106個時方可以保證成功地植入。本研究骨髓細胞數和脾細胞數分別為1×107和3×107，滿足實驗要求。

本研究中單純照射組小鼠照射后6～12d全部死亡，同基因移植組小鼠全部長期生存，無aGVHD征象，實驗組小鼠移植后11d再次出現活動減少，嗜睡，弓背，脫毛，腹瀉等典型aGVHD表現；肝臟、脾臟、皮膚病理切片檢查小鼠符合aGVHD征象；aGVHD的發(fā)病率100%。同時對同基因移植組和異基因移植組生存時間＞10d的所有小鼠（BALB/c，♀）進行PCR法擴增外周血Y染色體檢查，全部均檢查到Y染色體，提示供鼠（C57BL/6，♂）骨髓細胞植入成功。筆者成功建立同種異基因骨髓移植模型，且aGVHD表現典型，發(fā)病率100%，從開始發(fā)生aGVHD至小鼠全部死亡有7d時間，為筆者提供充分觀察aGVHD的時間。

綜上所述，C57BL/6→BALB/C作為MHC不相合異基因移植動物模型，具有重復性好，發(fā)病率高，aGVHD表現典型，可作為aGVHD研究的理想參照。