廣西梧州市桂東人民醫(yī)院（543001）姜洪剛

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院（530011）寧桂蘭 鄭景輝Δ

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占人類所有原發(fā)性顱內(nèi)新生物的40%～50%[1]。傳統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)或細(xì)胞培養(yǎng)來分類[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的分類系統(tǒng)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤可細(xì)分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞或混合少突膠質(zhì)細(xì)胞等。在各年齡組的發(fā)病率和死亡率都很高，但對其預(yù)后的研究仍較少[3][4][5][6]。核因子I（NFI）家族是專一位點(diǎn)DNA結(jié)合蛋白（也被稱為CTF或CATT box轉(zhuǎn)錄因子），在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[7][8]。NFIA參與神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)展的事實(shí)表明，它可能會在神腦膠質(zhì)瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，檢測NFIA在星形膠質(zhì)瘤中的表達(dá)并分析神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤與患者的生存之間的關(guān)系。結(jié)果表明，NFIA在人腦星形細(xì)胞瘤的生物學(xué)活動(dòng)中可能發(fā)重要作用。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 回顧性研究分析從2007年～2012年間在我院的63例患者病理標(biāo)本。病理審查后，2例保存不當(dāng)?shù)哪[瘤材料被剔除在外，余下的61例可利用組織樣本用于實(shí)驗(yàn)中。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 使用免疫組化染色的方法檢查NFIA的表達(dá)，首先對標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，脫石蠟后，熱抗原修復(fù)20min，使用以下抗體：NFIA1:3000（兔多克隆抗體）和GFAP1:50（小鼠單克隆的IgG1，DAKO）。NFIA多克隆抗體是針對人NFIA 478-492氨基酸的。一抗使用兔IgG作為陰性對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行蘇木精和伊紅（HE）染色。

附圖1 NFIA不同級別的星形細(xì)胞瘤的表達(dá)×400（A：WHOII中的表達(dá)，B：WHOIV中的表達(dá)）

1.3 免疫組織化學(xué)染色分析 使用Image Pro Plus6.0軟件，由同一病理學(xué)科醫(yī)生獨(dú)立進(jìn)行盲法分析，按照WHO的診斷分級標(biāo)準(zhǔn)對樣品先進(jìn)行病理診斷。NFIA表達(dá)的量化分析由2個(gè)研究者獨(dú)立進(jìn)行分析。通過計(jì)算切片視野中NFIA陽性細(xì)胞的數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)另估比值來確定NFIA的定量表達(dá)（視野倍率×400，每個(gè)切片3個(gè)視野，至少包含200腫瘤細(xì)胞）。NFIA染色細(xì)胞作為NFIA-表達(dá)細(xì)胞。由于內(nèi)皮細(xì)胞缺乏NFIA免疫反應(yīng)性被用來作為內(nèi)部背景陰性對照。兩個(gè)分析者讀數(shù)的平均值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 無疾病進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS） PFS定義為自診斷之日起，最小時(shí)間間隔的日期腫瘤的復(fù)發(fā)，進(jìn)展或最后的隨訪。

1.5 數(shù)據(jù)分析 患者的生存分析采用Kaplan-Meier方法，NFIA的表達(dá)各組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），使用SPSS16.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 不同級別人類星形細(xì)胞瘤NFIA的表達(dá) NFIA在所有級別的星形細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。其在WHO分級較低（WHOI和II）腫瘤細(xì)胞高比例表達(dá)，與WHO高等級（WHOIII和IV）細(xì)胞之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見附圖1和附表。值得注意的是，3例在腫瘤邊緣腫瘤細(xì)胞入侵血管周圍。這種表達(dá)模式表明NFIA可能在星形細(xì)胞瘤的腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮生物學(xué)作用，由于樣本量較少，本文中未做統(tǒng)計(jì)，值得進(jìn)一步研究（見附圖2）。

附圖2 腫瘤邊緣血管周圍細(xì)胞NFIA的表達(dá)×200

2.2 NFIA在惡性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)與PFS的關(guān)系 本組免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在惡性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤高級別腫瘤細(xì)胞與低級別腫瘤細(xì)胞有較少量表達(dá)，WHO III和IV級星形細(xì)胞瘤一般預(yù)后較差，這提示高NFIA表達(dá)與患者的生存有良好相關(guān)性。筆者將NFIA的表達(dá)按高低分為相等的三個(gè)組，根據(jù)患者PFS做了生存分析，結(jié)果顯示三組的中位生存時(shí)間分別是56、40、32個(gè)月，P＝0.004＜0.01。說明PFS明顯的與NFIA表達(dá)呈單變量復(fù)相關(guān)。

3 討論

NFIA是一種在小鼠和鳥類的胚胎發(fā)育過程中早表達(dá)、決定星形膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄因子。NFIA是NFI家族的成員之一，Cebolla B[9]研究顯示其在鼠類和鳥類心室發(fā)育中具有關(guān)鍵的作用，并且在大鼠的腦和脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞分化中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控的膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)來發(fā)揮作用。此外，在出生后的小鼠大腦中切除NFIA或NFIB，中線的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞群就會產(chǎn)生發(fā)育缺陷[10]。NFIA在人胎兒前腦的中線結(jié)構(gòu)中也有表達(dá)[11]。Scrideli[12]對20例低級別的GBM患者經(jīng)過RT-PCR進(jìn)行微陳列分析數(shù)據(jù)顯示神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NFI基因證實(shí)高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示NFIA在星形細(xì)胞瘤中有不同的表達(dá)，它高表達(dá)在低等級的星形細(xì)胞中。Bernard[13]報(bào)道了NFIA與人類白血病的關(guān)系，在他的研究中通過對2例慢性惡性骨髓疾病患者研究發(fā)現(xiàn)NFIA一些未知的表達(dá)。

盡管本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)提示NFIA參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)過程，但其機(jī)制尚未明確。因NFIA是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胚胎發(fā)育過程中必須的。它可在低級星形細(xì)胞分化中高表達(dá)，也反應(yīng)其在推進(jìn)星形細(xì)胞分化中的抑制作用。同時(shí)，NFIA在胚胎期脊柱中維持神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞特性方面暗示其可能參與腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞的作用。這提示一個(gè)基于遺傳和細(xì)胞背景的復(fù)雜作用機(jī)制，NFIA表達(dá)的具體作用體現(xiàn)在不同的亞型[14][15][16]。如在雞的胚胎成纖維細(xì)胞中，NFIA是不致癌的，且它的表達(dá)有助于細(xì)胞抗致癌基因引起的細(xì)胞分化，如jun、fos和myc基因（所有編碼轉(zhuǎn)錄的因子）[17]。但這些表達(dá)NFIA的雞細(xì)胞又容易在胞質(zhì)中致癌基因作用下分化如src，raf，ras基因。說明其通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路扮演著不同角色。發(fā)生以上情況的原因可能是很多亞型的不同作用，但在另一個(gè)亞型里卻發(fā)現(xiàn)具有促癌作用[18][19]。此外，遺傳背景也能發(fā)揮重要作用，在確定抗癌/促癌功能方面，這些已得到證明。

附表 不同級別人類星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤NFIA的表達(dá)（）

附表 不同級別人類星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤NFIA的表達(dá)（）

注：※與WHOI級比較P＜0.01，＃與WHOII級比較P＜0.01，△與WHOIII級比較P＜0.01。

級別 例數(shù) NFIA（%）WHO I 18 92.52±13.24 WHO II 20 79.69±9.57※WHO III 13 46.24±5.79※＃WHO IV 10 38.76±6.51※?！?/p>

尋找星形細(xì)胞瘤的標(biāo)記，長期以來一直是神經(jīng)病理學(xué)家和神經(jīng)腫瘤學(xué)家的目標(biāo)。但如Olig2和STAT3被認(rèn)為是作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的形成的標(biāo)記，都同樣表達(dá)在星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞，限定其診斷價(jià)值[20][21]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，NFIA在不同級別的星形細(xì)胞瘤的表達(dá)，作為病理分級的標(biāo)志，尤其是形態(tài)學(xué)很難評估的時(shí)侯值得關(guān)注。

Scrideli等[12]通過實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，檢測20 GBMS NFIA mRNA的表達(dá)高于10個(gè)樣品非腫瘤性蛋白質(zhì)超過13倍，但未檢查其與PFS或OS的關(guān)系。筆者證明NFIA在星形細(xì)胞瘤中的蛋白表達(dá)與更長的PFS顯著相關(guān)，盡管這是一個(gè)相對較小的分析PFS（23名兒童）的患者組。較大規(guī)模的研究，將可以確定NFIA是否可能是一個(gè)潛在的星形細(xì)胞瘤的預(yù)后指標(biāo)。筆者的免疫組織化學(xué)結(jié)果在蛋白質(zhì)水平證實(shí)了Scrideli等的數(shù)據(jù)。Schuur等[17]觀測的NFIA在雞胚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，使其能夠抵抗核內(nèi)癌基因改造的結(jié)果，NFIA在雞胚成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用說明它可以保護(hù)細(xì)胞免受進(jìn)一步轉(zhuǎn)變事件，但它的損失是暴露細(xì)胞使其惡性變的可能性增加。

總之，本實(shí)驗(yàn)表明低級與高級別星形細(xì)胞瘤之間的聯(lián)系：NFIA蛋白的表達(dá)和改善PFS與高級別星形細(xì)胞瘤在兒童中差異表達(dá)的NFIA。這是支持REMBRANDT GBM芯片分析數(shù)據(jù)庫。此外，筆者發(fā)現(xiàn)，在部分血管周圍腫瘤細(xì)胞NFIA蛋白呈高度濃縮現(xiàn)象，這提示我們在高等級星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，NFIA參與（或促進(jìn)或抑制）腫瘤細(xì)胞做浸潤和轉(zhuǎn)移。與此同時(shí)，粘附分子ephrin B1和鈣粘蛋白也被證實(shí)是NFIA的目標(biāo)之一[22]，其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)機(jī)制值得進(jìn)一步研究。