王娟勤 白繪宇 易成林 劉 娜 劉曉亞

(江南大學化學與材料工程學院,食品膠體與生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122）

1 引言

帶相反電荷的聚電解質(zhì)可在水溶液中通過靜電等相互作用自組裝形成不同形貌的功能性復合物,因而備受學術界青睞.1-7天然大分子因其獨特的生物相容性和親水性,可獲得更具潛在應用價值的聚電解質(zhì)復合物.8-11Boddohi等12制備的一系列不同電荷比(n+/n-）的殼聚糖-肝磷脂(chi-hep）復合納米粒子(PCN）及殼聚糖-透明質(zhì)酸(chi-ha）PCN可使基材具有不同表面形貌,為修飾生物材料表面提供了一種有效手段.Jiang課題組13-16分別以陽離子殼聚糖-陰離子丙烯酸(CS-AA）,陰離子海藻酸-陽離子甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(ALG-DEA）為聚合物-單體復合體系,通過單體的原位聚合得到了一系列由靜電作用誘導的尺寸可控、具有負載功能的CS-PAA空心納米粒子及ALG-PDEA納米粒子,提供了一種集原位聚合和靜電復合于一體制備天然大分子自組裝膠體粒子的新途徑.

透明質(zhì)酸(HA,p Ka=2.9±0.1）是一種直鏈線型陰離子粘多糖(示意圖1(a））,具有優(yōu)異的生物相容性及粘彈性,良好的水溶性和獨特的保濕性.17-20作為聚陰離子電解質(zhì),HA能與陽離子物質(zhì)通過靜電作用組裝成復合物.Lenormand等21的研究表明,在pH=4條件下103-106Da分子量范圍內(nèi)的HA都能與牛血清蛋白(BSA）通過靜電作用獲得HA-BSA復合物,其結構受HA分子鏈長度的影響.Xu等22,23研究了HA與光敏性1-甲基-4-(對甲酰苯乙烯基）吡啶甲基硫酸鹽(SbQ）在水溶液中的自組裝行為,獲得了具有光響應性和疏水性藥物負載功能的HA/SbQ復合膠束.

多糖和蛋白質(zhì)等天然大分子常作為“天然”乳化劑和穩(wěn)定劑制備水包油(O/W）乳液,以替代傳統(tǒng)乳化劑應用于食品和化妝品等領域.24-26透明質(zhì)酸因具有獨特的保濕性目前已廣泛用于高級化妝品,但其表面活性較差,無法單獨作為乳化劑穩(wěn)定乳液.T?mmeraas等27用烷烯基和芳香基琥珀酸酐(ASA）對HA接枝改性得到HA的衍生物ASA-HA,ASA的引入降低了HA的表面張力,從而改善了其乳化性.若能通過非共價作用提升HA乳化性,并拓展其應用會更有意義.

本文嘗試以荷負電的HA與水溶性陽離子單體甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DM,p Ka=8.3）28組成聚合物/單體復合體系,并通過DM原位聚合形成由靜電作用誘導的透明質(zhì)酸/聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(HA/PDM）自組裝復合膠體粒子(見示意圖1）.考察了反應時間和pH值對復合膠體粒子性質(zhì)的影響,并對所得膠體粒子的乳化性能及其影響因素進行初步探索,以期解決純HA乳化性能較差的問題,拓展透明質(zhì)酸在乳化方面的研究.

示意圖1 (a）HA/PDM復合膠體粒子的形成過程;(b）不同pH條件下HA/PDM復合膠體粒子在油/水界面的吸附行為Scheme 1 (a）Schematic illustration of the formation of HA/PDM complex colloid particles;(b）oil-in-water interfacial behavior of the HA/PDM complex colloid particles with different pH values

2 實驗部分

2.1 主要試劑

透明質(zhì)酸鈉:食品級,分子量為2.1×105Da,鎮(zhèn)江東元生物科技有限公司;甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DM）:99%(w）,上海晶純試劑有限公司,經(jīng)堿性氧化鋁過柱后使用;過硫酸鉀(KPS）、鹽酸、氫氧化鈉:分析純,中國醫(yī)藥集團上海試劑公司;白油:工業(yè)級,無錫市永真工業(yè)油品有限公司;透析袋:上海綠島科技發(fā)展有限公司.

2.2 主要儀器

傅里葉變換紅外(FTIR）光譜儀(2000-104型,加拿大FTLA公司）;ALV-5022型激光光散射(DLS,德國ALV公司,激光波長為632.8 nm,散射角為90°,溫度為(25.0±0.1）°C）;Nano-ZS90型納米粒度儀(英國Malvern公司）;Malvern Zetasizer2000型zeta電位儀(英國Malvern公司）;JEOL JEM-2100型透射電鏡(TEM,日本JEOL電子株式會社）;pH計(PHS-3C型,上海天達儀器有限公司）;冷凍干燥機(FD-1A-50型,北京博醫(yī)康實驗儀器公司）;XHF-D型高速分散器(寧波新芝生物科技有限公司）;DMBA450型光學顯微鏡(廈門麥克奧迪實業(yè)有限公司）.

2.3 除鹽透明質(zhì)酸的制備

稱取2.5 g透明質(zhì)酸鈉溶于100 mL去離子水中,攪拌下緩慢滴加1 mol·L-1鹽酸水溶液至pH為2.0左右,繼續(xù)攪拌1-2 h后將該溶液裝入透析袋(截留分子量8-14 kDa）,在去離子水中透析3天除去鈉離子和鹽酸,冷凍干燥得到除鹽透明質(zhì)酸(HA）樣品.

2.4 HA/PDM復合膠體粒子的制備

HA(0.5 g）和DM(0.294 g）溶于50 mL去離子水中,室溫攪拌2 h使其完全溶解,得到HA/DM混合溶液.加入1.5 g KPS水溶液(2.5%,w）,氮氣氛圍下升溫至60°C,KPS引發(fā)DM聚合反應,控制反應時間分別為15、30、60、90、120、180 min.最后將不同反應時間的反應液裝入透析袋(截留分子量3.5 kDa）,在pH=5.0的緩沖液中透析24 h以除去未反應單體,得到不同反應時間的HA/PDM復合膠體粒子溶液,定容至10 g·L-1,調(diào)節(jié)pH=5.0.同樣條件做空白實驗,不加KPS,僅以HA/DM混合溶液加熱反應.

2.5 HA/PDM復合膠體粒子的表征

2.5.1 HA/PDM復合物的FTIR表征

取少量HA/PDM復合溶液滴于載玻片上,置于40°C烘箱烘干成透明薄膜,將此薄膜用FTIR表征,分析HA/PDM復合物的特征吸收峰.

2.5.2 HA/PDM復合膠體粒子的粒徑及zeta電位表征

用DLS分別測定不同反應時間和pH值時HA/PDM復合膠體粒子溶液的光散射強度、粒徑及其分布.樣品測試濃度為1.0 g·L-1,經(jīng)直徑為0.8 μm的微孔過濾膜除塵.

用zeta電位儀分別測定不同反應時間和pH值時HA/PDM復合膠體粒子的zeta電位.樣品測試濃度為1.0 g·L-1,經(jīng)直徑為0.8 μm的微孔過濾膜除塵.

2.5.3 HA/PDM復合膠體粒子的形貌表征

將銅網(wǎng)放在覆有濾紙的表面皿中,取一滴(約7 μL）HA/PDM復合膠體粒子溶液(0.1 g·L-1,pH=5.0）滴于銅網(wǎng)上,室溫干燥后用TEM觀察膠體粒子形貌.

2.6 乳液的制備與表征

以2.4節(jié)所得10 g·L-1的HA/PDM復合膠體粒子溶液作為水相,白油為油相,體積比為1/1,用XHF-D型高速分散器以8000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)2 min.

通過電導率法和稀釋法確定乳液類型.用數(shù)碼相機拍攝乳狀液放置一定時間后的表觀狀態(tài).取乳狀液用去離子水稀釋,用DMBA450型光學顯微鏡觀測乳液滴形態(tài)、大小及分布.

3 結果和討論

3.1 HA/PDM復合物的FTIR表征

FTIR是研究聚電解質(zhì)復合體系中兩種物質(zhì)間相互作用的常用表征手段.16,29純HA、純PDM和HA/PDM復合物的FTIR譜圖如圖1所示.HA的譜圖中1732 cm-1歸屬于羧基的ν(C＝O）吸收峰,而HA/PDM譜圖中此吸收峰強度減弱且右移至1717 cm-1,同時在1610 cm-1出現(xiàn)了新的吸收峰,為HA的ν(COO-）反對稱吸收峰,這是由于HA中羧基與PDM中質(zhì)子化的叔胺形成了離子鍵所致,而在HA和PDM譜圖中,此吸收峰并不明顯,說明HA和PDM間存在靜電相互作用.

3.2 HA與PDM在水溶液中的自組裝行為

用DLS追蹤了2.4節(jié)所述過程,不同反應時間下HA與PDM復合體系在水溶液中的自組裝行為,結果如圖2所示.

圖1 HA、PDM和HA/PDM復合物的FTIR譜圖Fig.1 FTIR spectra of HA,PDM,and HA/PDM complex

從圖2可知,隨反應時間延長,HA/DM溶液的光散射強度較小且基本不變,說明溶液中無引發(fā)劑KPS時,DM未聚合,以單體形式分散在水溶液中,HA則以無規(guī)聚集體形式存在于水溶液中,兩者并未形成復合物聚集體,光散射強度較小;而加入KPS后,DM的逐步聚合使得HA/PDM復合溶液光散射強度隨反應時間增加而逐漸增大,說明HA/DM復合體系經(jīng)KPS引發(fā)后DM原位聚合形成PDM,PDM和HA間存在較強的靜電相互作用,誘導HA/PDM自組裝形成復合膠體粒子,因而光散射強度增大,該形成過程如示意圖1(a）所示.

3.3 HA/PDM復合膠體粒子的粒徑和zeta電位

用DLS和zeta電位儀研究了反應時間對HA/PDM復合膠體粒子粒徑及zeta電位的影響,結果如圖3所示.

圖2 反應時間(t）對HA/DM及HA/PDM復合溶液光散射強度的影響Fig.2 Influence of polymerization time(t）on the scattering intensities of the HA/DM and HA/PDM complex solution

圖3 HA、PDM和HA/PDM復合膠體粒子粒徑(D h）及zeta電位隨反應時間的變化曲線Fig.3 Average hydrodynamic diameters(D h）and zeta potential of HA,PDM,and HA/PDM complex colloid particles as a function of polymerization time

圖3(b）為不同反應時間(t）下HA/PDM復合膠體粒子的粒徑變化.t=0 min時,溶液中無HA/DM復合膠體粒子存在.t=15 min時,DM逐漸聚合形成PDM,PDM與HA之間因靜電作用形成較松散復合膠體粒子,此時復合溶液的光散射強度為32.2(圖2）,膠體粒子粒徑(Dh）為(291.4±0.75）nm.隨聚合反應的進行,膠體粒子粒徑逐漸變小,說明HA和PDM的靜電作用加強,HA鏈與PDM鏈段纏繞更加緊密,使粒子收縮,因而粒徑減小并趨于穩(wěn)定.Jiang等15研究了CS-PAA納米粒子也得到類似結果.而作為空白對照的HA和PDM溶液,光散射強度全程基本無變化,DLS無法測得粒徑,說明單純的HA體系和PDM體系延長反應時間始終無聚集現(xiàn)象發(fā)生.HA溶液的zeta電位均為負值,PDM溶液的zeta電位均為正值,而HA/PDM復合膠體粒子溶液的zeta電位介于兩者之間,說明HA和PDM鏈段間確實存在靜電相互作用,誘導復合膠體粒子生成,離子化HA-COO-鏈在粒子表面富集,使得粒子表面荷負電,起到穩(wěn)定粒子作用.

3.4 HA/PDM復合膠體粒子的形貌

為直觀地觀察HA/PDM復合膠體粒子形成前后體系狀態(tài),對HA/DM混合體系和HA/PDM復合物進行TEM拍攝,如圖4所示.當DM聚合反應開始前(圖4(a））,未觀察到規(guī)則膠體粒子,溶液中無HA/DM復合物聚集體存在.DM聚合后(圖4(b）,t=180 min）,HA/PDM復合膠體粒子則呈球形,粒徑分布較寬.

TEM觀察到的膠體粒子平均粒徑略小于DLS測試結果((238.80±1.04）nm）,這是因為DLS是在溶液狀態(tài)測試,粒子因親水性較強而充分溶脹;TEM則在干態(tài)下測試,粒子在干態(tài)下產(chǎn)生塌陷收縮,導致粒徑變小.30

圖4 HA/DM(a）和聚合180 min得到的HA/PDM復合膠體粒子(b）的TEM圖像Fig.4 TEM images of HA/DM(a）and HA/PDM complex colloid particles obtained after 180 min polymerization(b）

3.5 HA/PDM復合膠體粒子的pH敏感性

HA和PDM均具有pH敏感性,因此pH值會對膠體粒子的zeta電位和粒徑產(chǎn)生影響.HA/PDM復合膠體粒子的zeta電位隨pH值變化曲線如圖5a所示,發(fā)現(xiàn)隨pH值增大,zeta電位值逐漸減小,并出現(xiàn)了由正到負的轉(zhuǎn)變.這是由于pH較低時(pH＜2.85）,羧酸基團電離受到抑制,而－NH－和－N(CH3）2基團質(zhì)子化程度較大,使得HA/PDM復合物的凈電荷為正,zeta電位值為正.當pH值為2.85時,膠體粒子的zeta電位值為零,其對應的pH值為等電點.隨pH值升高,羧酸根電離程度增大,zeta電位值遞減.對比純HA電位變化曲線(圖5b）發(fā)現(xiàn),HA/PDM復合膠體粒子的電位值均大于HA,這是由于PDM與HA存在相互作用,中和了部分羧酸根所致.

HA/PDM復合膠體粒子的粒徑隨pH值變化曲線如圖5c所示,由于HA和PDM鏈離子化程度受pH影響,膠體粒子粒徑受pH影響也較大.當pH=1.49時,PDM質(zhì)子化程度很高,而HA羧酸根電離程度很低,體系荷正電,靜電與氫鍵協(xié)同作用使得膠體粒子結構較穩(wěn)定,粒徑較小.當pH=2.50-3.00時,接近膠體粒子等電點,粒子間因靜電斥力消失而絮凝,26因此粒徑急劇增大(區(qū)域I）.pH=3.50-4.00時,絮凝消失,膠體粒子重新形成且粒徑較小;進一步提高pH值,PDM質(zhì)子化程度減小,誘導膠體粒子收縮,而HA離子化程度增加,親水性增強促使膠體粒子溶脹,在兩者共同作用下膠體粒子的粒徑緩慢增大.當pH＞8.07時,HA離子化程度進一步增強使得分子鏈充分溶脹伸展,而PDM的質(zhì)子化受到抑制,故兩者無法通過靜電作用形成復合物(區(qū)域II）.對于純HA溶液,由于不同pH值下均為無色透明,不能形成膠體粒子,光散射強度很低,因此DLS無法測得粒徑.

圖5 HA/PDM復合膠體粒子和HA的粒徑及zeta電位隨pH值變化曲線Fig.5 Average hydrodynamic diameters and zeta potential of HA/PDM complex colloid particles and HA versus pH values

3.6 HA/PDM復合膠體粒子的乳化性能

以2.4節(jié)所得HA/PDM復合膠體粒子水溶液為水相,白油為油相,體積比為1/1,經(jīng)2.6節(jié)的方法進行充分乳化制備乳液,經(jīng)電導率法和稀釋法確定所得乳液為O/W型.由于HA/PDM復合膠體粒子具有pH敏感性,其表面性質(zhì)會受pH影響,從而影響其乳化性能,因此本文初步考察了pH對HA/PDM復合膠體粒子溶液乳化性能的影響,以純HA溶液和純PDM溶液進行空白對照實驗.

對純HA體系而言,pH值對其穩(wěn)定的O/W乳液滴粒徑的影響如圖6(a）所示,當pH=2.50時,乳狀液最穩(wěn)定,乳液滴粒徑較小且分布較均一,原因是此pH值接近HA等電點,羧酸根電離度較小使HA荷電量較低,親水性減弱,在油水界面吸附能力增強;同時HA分子內(nèi)及分子間氫鍵作用增強,形成了氫鍵網(wǎng)絡結構,粘度急劇增大,具有類似溶膠-凝膠行為,17,31降低了油滴的運動速度從而阻止油滴聚并,得到穩(wěn)定乳液.32,33提高HA溶液pH,乳液滴粒徑迅速增大,乳化性能較弱,說明pH增加使HA羧酸根電離程度增大,荷電量升高,靜電排斥力增大;同時HA親水性增強,易于從油水界面脫離進入水相,造成宏觀破乳.

圖6 不同pH值時HA、PDM和HA/PDM復合膠體粒子水溶液乳化白油的O/W乳液靜置48 h后的光學顯微鏡照片及表觀數(shù)碼照片F(xiàn)ig.6 Optical micrographs and digital photographs of O/W emulsions(48 h after emulsification）stabilized by HA,PDM,and HA/PDM complex colloid particles aqueous solution with various pH values

pH值對PDM溶液穩(wěn)定的O/W乳液滴粒徑的影響如圖6(b）所示,當pH=1.50時,由于叔胺充分質(zhì)子化,PDM親水性較強,表面活性較差,基本無乳化性,乳液滴粒徑較大.在pH值為5.10-7.50之間時,乳化性能則有較大提高,乳液滴粒徑減小,原因是叔胺質(zhì)子化程度減小,PDM呈弱疏水性以傳統(tǒng)大分子鏈形式吸附于油水界面.34進一步提高溶液pH值到9.00時,乳液滴粒徑明顯增大且分布不均一,乳液層高較低,乳化性能減弱,可能由于過堿條件下PDM質(zhì)子化受到抑制,鏈段疏水性增強不易在界面上穩(wěn)定吸附,乳液滴易聚并.

pH值對HA/PDM復合膠體粒子溶液穩(wěn)定的O/W乳液滴粒徑的影響如圖6(c）所示.當pH=1.49時,乳液滴粒徑較小,乳液穩(wěn)定,原因是羧酸基團電離作用受到抑制,HA/PDM復合膠體粒子粒徑較小(圖5c）,親水性減弱,能穩(wěn)定吸附于油水界面,乳化效果較好,見示意圖1(b）.當pH=5.14時,羧酸基團電離度增大,膠體粒子親水性增強,乳液滴粒徑變大,但乳液穩(wěn)定性仍較純HA體系好.當pH=7.54時,膠體粒子因HA電離度增大而溶脹,乳液穩(wěn)定性較HA有較大提高,可能原因是膠體粒子溶脹與外圍大分子鏈共同作用在油水界面形成協(xié)同效應,使得乳液較穩(wěn)定,見示意圖1(b）.pH=9.03時,HA鏈段間靜電排斥力增強而充分溶脹,膠體粒子結構松散甚至部分解離,但乳化效果卻進一步提高,乳液滴粒徑較小且分布均一,乳液層高度較高,明顯優(yōu)于純HA和PDM體系的乳化性能,可能主要是以PDM/HA大分子鏈表面活性劑的形式起乳化作用,35故乳液穩(wěn)定,見示意圖1(b）.

4 結論

以陰離子HA與陽離子DM組成聚合物/單體復合體系,在水溶液中成功地通過DM原位聚合制備了PDM,由HA羧酸根離子和PDM叔胺離子之間靜電作用誘導自組裝得到球形HA/PDM復合膠體粒子.在0-180 min反應時間內(nèi),膠體粒子的zeta電位均為負值,其粒徑隨反應時間延長逐漸減小并趨于穩(wěn)定.pH值對膠體粒子的表面性質(zhì)有較大影響,通過改變pH值可得到不同荷電量和粒徑的膠體粒子,但較堿性條件下(pH＞8.07）HA和PDM間的靜電作用較弱而無法形成復合物聚集體.此外,HA/PDM復合膠體粒子乳化性能受pH值影響也較大,較酸性(pH=1.49）和較堿性(pH=9.03）條件下乳液穩(wěn)定性較佳,同時HA/PDM復合體系的乳化性能較純HA和PDM均有較大提高,實現(xiàn)了以非共價作用提升HA乳化性能的新途徑.

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