，，，，

(1.江蘇省泰州市姜堰區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇泰州 225500； 2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司)

牛奶中的抗生素含量會影響牛奶的進(jìn)一步發(fā)酵加工，許多國家及聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)等國際機(jī)構(gòu)都作出規(guī)定：奶牛在接受抗生素治療期間及用藥后數(shù)日內(nèi)的乳汁不得用于生產(chǎn)商品乳[1,2]。盡管如此，仍有部分農(nóng)場或奶農(nóng)無視相關(guān)規(guī)定，向乳品加工企業(yè)提供含有抗生素的原奶。因此，對乳品加工企業(yè)來說，抗生素已成為原奶收購環(huán)節(jié)中必不可少的檢測項目[3]。

大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素四聯(lián)膠體金快速檢測試紙條，是以膠體金技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)的一種靈敏度高、檢測時間短、準(zhǔn)確度高、易貯存、攜帶方便、現(xiàn)場操作簡便、可一次檢測4種抗生素的快速檢測產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于牛奶收購、流通、生產(chǎn)、銷售等環(huán)節(jié)的牛奶中抗生素篩查，10 min內(nèi)就可檢測出結(jié)果。本試驗對大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素四聯(lián)膠體金快速檢測試紙條的檢測限、特異性、重復(fù)性、假陽性率、假陰性率以及影響膠體金檢測效果的主要因素等方面進(jìn)行了評價。

1 試驗材料

大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素四聯(lián)膠體金快速檢測試紙條由北京某生物科技有限公司生產(chǎn)，批號H20120913B20。 牛奶樣本 購自超市。大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素及其他抗生素標(biāo)準(zhǔn)品由sigma公司提供。

2 試驗方法

2.1檢測方法與結(jié)果判斷 采用微量移液器吸取200 μL待檢牛奶樣品于凍存有膠體金標(biāo)記抗體的微孔中，緩慢抽吸至牛奶充分與微孔中試劑混勻。將試紙條插入微孔中-印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中。 室溫(20～25 ℃)孵育5 min后，取出試紙條觀察顏色，判定結(jié)果。

陰性(-)：C線顯色，T線顯色，無論顏色深淺，均表示牛奶樣本中大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素濃度低于檢測限。

陽性(+)：C線顯色，T1線不顯色，表示牛奶樣本中大觀霉素濃度等于或高于檢測限； C線顯色，T2線不顯色，表示牛奶樣本中鏈霉素濃度等于或高于檢測限； C線顯色，T3線不顯色，表示牛奶樣本中慶大霉素濃度等于或高于檢測限； C線顯色，T4線不顯色，表示牛奶樣本中新霉素濃度等于或高于檢測限(詳見圖1)。

無效：未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已失效。

圖1 試紙條檢測結(jié)果判定

2.2最低檢測限試驗 將不同濃度的大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加的牛奶樣品分為5組，每組樣品10份，其中大觀霉素各組濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L、25 μg/L；慶大霉素各組濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、15 μg/L、20 μg/L、25 μg/L；新霉素各組濃度分別為200 μg/L、300 μg/L、400 μg/L、500 μg/L、600 μg/L；鏈霉素各組濃度分別為20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L、80 μg/L、100 μg/L。分別用試紙條檢測，5 min后觀察結(jié)果。

2.3特異性試驗 將牛奶中常見的其他抗生素(青霉素G、頭孢洛寧、四環(huán)素、紅霉素、林可霉素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶)添加到陰性牛奶樣品中，使其終濃度為500 μg/L，分別用試紙條重復(fù)檢測5次，5 min后觀察結(jié)果。

2.4重復(fù)性試驗 分別用添加大觀霉素20 μg/L、慶大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、鏈霉素80 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的陽性牛奶和陰性牛奶各1份，分別用試紙條進(jìn)行重復(fù)檢測20次，5 min后觀察結(jié)果。

2.5不同溫度檢測 分別用添加大觀霉素20 μg/L、慶大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、鏈霉素80 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的陽性和陰性牛奶各5份，分別在室溫條件下(25℃)、培養(yǎng)箱(37℃)和冰箱(4℃)中用試紙條進(jìn)行檢測， 5 min后觀察結(jié)果。

2.6不同濕度檢測 分別用添加大觀霉素20 μg/L、慶大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、鏈霉素80 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品陽性牛奶和陰性牛奶各5份，分別在氣候箱中相對濕度為30%～40%， 60%～70%，85%～90%時用試紙條檢測，5 min后觀察結(jié)果。

2.7假陽性率 隨機(jī)用陰性牛奶樣品50份，用試紙條檢測，5 min后觀察結(jié)果，以考察試紙條的假陽性率。

2.8假陰性率 隨機(jī)用添加大觀霉素20 μg/L、慶大霉素20 μg/L、新霉素500 μg/L、鏈霉素80 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的陽性牛奶樣品50 份，用試紙條檢測，5 min后觀察結(jié)果，以考查試紙條的假陰性率。

3 結(jié)果與分析

3.1試紙條最低檢測限 牛奶中大觀霉素含量<15 μg/L時，均出現(xiàn)陰性結(jié)果，≥20 μg/L時，均出現(xiàn)陽性結(jié)果，15 μg/L時，檢測10份樣品中有1份出現(xiàn)陽性結(jié)果，檢出率為10%；慶大霉素含量<15 μg/L時，均出現(xiàn)陰性結(jié)果，≥20 μg/L時，均出現(xiàn)陽性結(jié)果，15 μg/L時，檢測10份樣品中有2份出現(xiàn)陽性結(jié)果，檢出率為20%；新霉素含量≤400 μg/L時，均出現(xiàn)陰性結(jié)果，≥500 μg/L時，均出現(xiàn)陽性結(jié)果；鏈霉素含量≤60 μg/L時，均出現(xiàn)陰性結(jié)果，≥80 μg/L時，均出現(xiàn)陽性結(jié)果(詳見表1)。為避免在實際應(yīng)用中出現(xiàn)假陰性結(jié)果，給乳制品企業(yè)帶來潛在威脅，在本試驗條件下試紙條的最低檢測限規(guī)定為：大觀霉素20 μg/L；慶大霉素20 μg/L；新霉素500 μg/L；鏈霉素80 μg/L。

表1 不同濃度抗生素牛奶檢測結(jié)果

3.2特異性試驗 分別對添加500 μg/L青霉素G、頭孢洛寧、四環(huán)素、紅霉素、林可霉素、氯霉素、磺胺二甲基嘧啶的牛奶樣品進(jìn)行檢測，檢測線和質(zhì)控線均顯色，結(jié)果為陰性，所以試紙條特異性較好。

3.3重復(fù)性試驗 陽性牛奶與陰性牛奶重復(fù)檢測結(jié)果見表2。 結(jié)果顯示，所檢樣品中，只有1份陰性牛奶樣品在進(jìn)行慶大霉素檢測時出現(xiàn)陽性結(jié)果，總體陰性牛奶與陽性牛奶重復(fù)檢測結(jié)果均一，表明該試紙條重復(fù)性較好。

表2 試紙條重復(fù)性檢測

3.4溫度影響 不同溫度條件下的檢測結(jié)果，詳見表3。 結(jié)果表明，在25℃條件下進(jìn)行檢測，未出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；在37℃或4℃，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，但影響并不顯著。

表3 溫度的影響試驗

3.5濕度影響 不同濕度條件下的檢測結(jié)果，詳見表4。 結(jié)果表明，在相對濕度60%～70%條件下進(jìn)行檢測，未出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；在相對濕度30%～40%和85～90%條件下檢測，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，尤其在相對濕度85%～90%時，影響顯著。

表4 濕度的影響試驗

3.6假陽性率試驗 檢測50份陰性牛奶，結(jié)果48份呈陰性，2份呈陽性，即假陽性率為4%。

3.7假陰性率試驗 檢測50份陽性牛奶，結(jié)果均呈陽性。

4 討 論

經(jīng)試驗表明，環(huán)境溫度對檢測結(jié)果有一定影響，在普通實驗室溫度結(jié)果顯示良好。主要是由于試紙條所需牛奶樣品量很少，高溫時牛奶中的水分容易蒸發(fā)，低溫時牛奶中的水分流動性變差，從而影響檢測結(jié)果，所以使用試紙條檢測時推薦在室溫(25℃)進(jìn)行。50%～70%濕度條件下檢測結(jié)果良好。

本試驗中，試紙條沒有出現(xiàn)假陰性，符合檢驗要求。由于牛奶檢測的影響因素甚多，如采樣時間，所留標(biāo)本時間長短，提供標(biāo)本者的飲食情況，以及檢測時的環(huán)境條件，都將影響檢測結(jié)果，尤其是牛奶樣本成分復(fù)雜，特別是在含有所檢抗生素結(jié)構(gòu)相近的代謝物時，都將導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。由于試紙條主要用于篩選，可以允許一定的假陽性率，所以出現(xiàn)4%的假陽性率屬可接受范圍之內(nèi)。

根據(jù)有關(guān)資料，經(jīng)抗生素治療的奶牛必須有最短2d，最長45d的休藥期，休藥期之后所產(chǎn)鮮奶方可出售或作為乳制品加工原料乳[4]。所以經(jīng)抗生素治療的奶牛，其所產(chǎn)牛奶在休藥期內(nèi)禁止在市場上出售或作為乳制品加工原料乳，由于利益驅(qū)使，僅僅依靠生產(chǎn)單位的自我約束力是不夠的，收購單位在收購牛奶時應(yīng)對牛奶中殘留抗生素進(jìn)行檢測和監(jiān)控[5,6]。

大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素四聯(lián)膠體金快速檢測試紙條由于具有準(zhǔn)確度高、檢測時間短、攜帶方便、無需儀器和洗滌步驟等優(yōu)點，因此大大地提高了檢測效率，十分適合現(xiàn)場快速檢測，作為一種快速篩查的手段可以有效地彌補(bǔ)廣大基層單位因設(shè)備和經(jīng)費問題而無法開展食品中大觀霉素、慶大霉素、新霉素、鏈霉素的檢測和監(jiān)控，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會價值。

[1]郁蓉,王歲樓.原料奶安全檢測及質(zhì)量控制的研究進(jìn)展[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2009,32(6):289-293.

[2]張小勇.建立健全鮮奶質(zhì)量管理體系[J].中國奶牛，2005(4):53-54.

[3]孫妮娜,秦向陽,楊寶祝,等.國內(nèi)外農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展現(xiàn)狀與分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(3):124-126.

[4]李洪忠,蔡生勝.鮮牛奶中抗生素殘留的檢測[J].China Cattle Science，2008，34(2):26-27.

[5]李文紅,孫麗新.我國奶業(yè)質(zhì)量安全情況分析[J].食品研究與開發(fā)，2006,27(1):175-178.

[6]白淑萍,閻愛莉,蘭淑東,等.市售鮮牛奶中抗生素殘留的檢測及今后建議[J].丹東醫(yī)藥，2007(4):22-23.