蘇儉生 全知怎

(同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院修復(fù)科 上海 200072)

在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，金屬材料被廣泛應(yīng)用于臨床，牙科鑄造合金在口腔復(fù)雜的生物環(huán)境中存在許多影響金屬材料穩(wěn)定性的因素?？谇恢谐练e的食物殘?jiān)屯僖?、溫度的波?dòng)和pH值的變化形成了腐蝕的環(huán)境條件，使金屬材料受到生物侵蝕，釋放金屬離子，從而引起身體的某些生物反應(yīng)。其中合金金屬鎳離子(Ni2+)作為常用牙科鑄造合金離子有明顯的致癌作用［1－4］。

對(duì)于飲茶人群，國(guó)內(nèi)外有較多關(guān)于表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)的報(bào)道，但其與金屬離子共同作用后對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響及相關(guān)的機(jī)制未見報(bào)道。本研究目的在于了解EGCG與牙科鑄造Ni2+對(duì)舌鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響，并進(jìn)一步研究其對(duì)有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期作用的cyclinD1及凋亡抑制蛋白IAP家族成員survivin基因表達(dá)的影響，從而為口腔臨床選用合金種類提供理論依據(jù)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料 EGCG(美國(guó)Sigma公司);氯化鎳(NiCl2，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，250 g)，試劑溶于去離子水中，配成待測(cè)液;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技公司);cyclinD1單克隆抗體，survivin單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司);PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Premix Ex Taq(大連TaKaRa公司)。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 舌鱗癌細(xì)胞Cal-27(美國(guó)ATCC公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，青鏈霉素各100 IU/mL)37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，0．25%胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞解凍復(fù)蘇后傳代2～3次進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 運(yùn)用MTT檢測(cè)法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Cal-27細(xì)胞，以5×104/mL接種于96孔板中，每孔接種100μL，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)基中加入不同濃度EGCG或金屬離子Ni2+，終濃度分別為1、50、100、200、300、400、600、800 μmol/L。對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，24 h后加入MTT溶液50μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)上清，每孔加入DMSO 150μL，水平振蕩10 min至結(jié)晶完全溶解，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光度值(D)，記錄結(jié)果。細(xì)胞存活率%=(D實(shí)驗(yàn)組/D對(duì)照組)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，繪制細(xì)胞存活曲線。

實(shí)時(shí)熒光定量(real-time PCR)檢測(cè)cyclinD1和survivin基因轉(zhuǎn)錄水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL接種于6孔板中，每孔1 mL，24 h細(xì)胞貼壁后加入2 mL不同濃度EGCG或Ni2+，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞。

總RNA提取:Trizol法提取總RNA，1．5%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)，測(cè)定D260/D280，確定RNA 濃度及純度為1．8～2．0。

cDNA合成:10μL逆轉(zhuǎn)錄體系:PrimeScript緩沖液 5 μL，PrimeScript RT 酶 Mix I 0．5 μL，Oligo dT Primer 0．5 μL，RNase Free dH2O 5．5 μL;總 RNA 1 μL(0．5 μg/μL)。經(jīng) 37℃、15 min，85℃、5 s后合成cDNA。

real-time PCR:Primer 5．0設(shè)計(jì)引物:GAPDH上游引物:CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG;GAPDH下游引物:AAAGGTGGA GGAGTGGG-TGTCG;survivin上游引物 :ATAGAGTGATAG-GAAGCGT CTG;survivin下游引物 :AGCATCGAGCCAAGTCAT;cyclinD1上游引物 :CTAGCAAGCTGCCGAACC;cyclinD1下游引物 :TCCGAGCACA GGATGACC。real-time PCR反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Primix Ex TaqTM10 μL，正向引物 0．4 μL，反向引物 0．4 μL，cDNA 2 μL(0．1 μg/μL)，dH2O 7．2 μL。95℃預(yù)變性 10 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，50 個(gè)循環(huán)。

Western blot檢測(cè)cyclinD1和survivin蛋白轉(zhuǎn)錄水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105/mL接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿中，24 h細(xì)胞貼壁后加入4 mL不同濃度EGCG及金屬離子Ni2+，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞。用RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解細(xì)胞后，14 000×g離心5 min，BCA法測(cè)定上清液中蛋白濃度。40μg蛋白在SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h后與cyclinD1或survivin兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜，復(fù)溫2 h后漂洗，熒光二抗避光孵育30 min后漂洗，用odyssey顯色，掃描蛋白條帶的灰度值，并分析結(jié)果。

數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)記錄為 x—±s，One-way ANOVA檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

EGCG、Ni2+及EGCG+Ni2+對(duì)細(xì)胞存活率的影響 MTT結(jié)果顯示:EGCG濃度較低(≤100 μmol/L)時(shí)，其對(duì)舌鱗癌細(xì)胞有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，但其作用并無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．12);當(dāng)濃度大于100μmol/L小于300μmol/L時(shí)，呈濃度依賴性抑制舌鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)EGCG的濃度＞300 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的存活率＜30%，且不隨濃度的增大而升高，存活率維持在較低的水平(圖1)。

圖1 EGCG對(duì)舌鱗癌細(xì)胞存活率的影響Fig 1 The cytotoxic effect of EGCG on Cal-27 cells

當(dāng)Ni2+濃度＞200μmol/L時(shí)，細(xì)胞隨濃度的增加有下降的趨勢(shì)，表明Ni2+抑制舌鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)呈濃度依賴性;在EGCG+Ni2+組中，EGCG濃度統(tǒng)一采用100μmol/L，各組依次加入不同濃度Ni2+，與對(duì)照組相比，EGCG+Ni2+組的細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，并隨Ni2+濃度增大，抑制作用也相對(duì)增大，當(dāng)濃度增加到800μmol/L時(shí)，細(xì)胞幾乎全部死亡。對(duì)比Ni2+及EGCG+Ni2+兩組細(xì)胞的存活率，EGCG+Ni2+組細(xì)胞抑制率更明顯(圖2)。

EGCG、EGCG+Ni2+對(duì)舌鱗癌細(xì)胞cyclinD1和survivin mRNA表達(dá)的影響 EGCG對(duì)舌鱗癌細(xì)胞cyclinD1基因mRNA的表達(dá)隨濃度的增加產(chǎn)生了抑制作用，從200μmol/L開始表現(xiàn)出抑制作用(P=0．046);對(duì)survivin基因mRNA的表達(dá)呈濃度依賴性抑制作用，從200μmol/L開始表現(xiàn)出抑制作用(P=0．044，圖3)。

EGCG+Ni2+對(duì)舌鱗癌細(xì)胞 cyclinD1，survivin mRNA表達(dá)的抑制率隨Ni2+濃度的增加而增大，從100μmol/L開始表現(xiàn)出抑制作用(P=0．041，P=0．045，圖4)。

圖2 Ni2+及EGCG+Ni2+對(duì)舌鱗癌細(xì)胞存活率的影響Fig 2 Effects of cytotoxicity of Ni2+and EGCG+Ni2+in Cal-27 cells

圖3 EGCG對(duì)舌鱗癌細(xì)胞cyclinD1/survivin mRNA表達(dá)的影響Fig 3 Effect of EGCG on cyclinD1/survivin mRNA level of Cal-27 cells

圖4 EGCG+Ni2+對(duì)舌鱗癌細(xì)胞cyclinD1/survivin mRNA表達(dá)的影響Fig 4 Effect of EGCG+Ni2+on cyclinD1/survivin mRNA level of Cal-27 cells

EGCG、EGCG+Ni2+對(duì)舌鱗癌細(xì)胞中cyclinD1和survivin蛋白表達(dá)的影響 用不同濃度EGCG作用于舌鱗癌細(xì)胞24 h，Western blot法檢測(cè)cyclinD1和survivin蛋白表達(dá)變化(圖5)。結(jié)果顯示EGCG處理后舌鱗癌細(xì)胞中cyclinD1蛋白和survivin蛋白表達(dá)明顯下降(P=0．024，P=0．042)。

圖5 EGCG處理后舌鱗癌細(xì)胞cyclinD1，survivin蛋白表達(dá)量Fig 5 Effect of EGCG on cyclinD1/survivin protein level of Cal-27 cells

100 μmol/L EGCG+100 μmol/L、200 μmol/L 或400μmol/L Ni2+作用于舌鱗癌細(xì)胞24 h，Western blot法檢測(cè)cyclinD1和survivin蛋白表達(dá)變化(圖6)。100μmol/L EGCG作為對(duì)照組，結(jié)果顯示EGCG+Ni2+處理后舌鱗癌細(xì)胞中 cyclinD1和survivin蛋白表達(dá)均顯著下降，且與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0．028，P=0．021)。

圖6 EGCG+Ni2+處理后舌鱗癌細(xì)胞cyclinD1，survivin蛋白表達(dá)量Fig 6 Effect of EGCG+Ni2+on cyclinD1/survivin protein level of Cal-27 cells

討 論

綠茶對(duì)人體大多數(shù)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用。EGCG作為茶葉中主要成分茶多酚的重要組成部分，是一種重要的抗氧化劑及自由基清除劑，具有抗癌、預(yù)防心血管疾病、抗自由基DNA損害、抗輻射、降低低密度膽固醇等作用。另一方面，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，尤其是修復(fù)、正畸、種植治療領(lǐng)域，金屬材料被越來越廣泛應(yīng)用于臨床，但對(duì)于綠茶中主要成分EGCG與修復(fù)體在口腔環(huán)境中析出多種金屬離子對(duì)癌細(xì)胞的影響卻鮮見報(bào)道，且作用機(jī)制尚不明確。因此本實(shí)驗(yàn)從EGCG與牙科鑄造合金析出的金屬離子共同作用出發(fā)，研究EGCG與Ni2+對(duì)舌鱗癌細(xì)胞中有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期作用的cyclinD1及凋亡抑制蛋白IAP家族成員survivin基因表達(dá)的影響。

大量研究證實(shí)EGCG對(duì)前列腺癌、胃癌、直腸癌、乳腺癌等人體大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有抑制作用［5－8］。Ni2+作為常用牙科鑄造合金離子有明顯的致癌作用，對(duì)于正常細(xì)胞可通過阻滯細(xì)胞周期G2/M來影響細(xì)胞的增殖率，Ni2+介導(dǎo)的cyclinB1的過表達(dá)及下調(diào)cyclinD1和cyclinE的表達(dá)量使細(xì)胞對(duì)DNA損傷更加敏感，從而增加了癌變的可能［1］。Ni2+還可通過增加 IL-8，TGF-β，MMP2，MMP9 基因的表達(dá)量及對(duì)TLR4信號(hào)通路的影響而顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲性［2］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGCG和Ni2+能抑制舌鱗癌細(xì)胞Cal-27的生長(zhǎng)且具有濃度依賴性，Ni2+與EGCG共同作用后使Ni2+對(duì)舌鱗癌細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，與單獨(dú)用其中任意一個(gè)相比抑制作用都更加顯著，說明Ni2+與EGCG對(duì)細(xì)胞的毒性有協(xié)同作用。

survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族中的新成員，可抑制細(xì)胞凋亡并參與調(diào)控細(xì)胞分裂。survivin基因較其他凋亡調(diào)控基因的優(yōu)勢(shì)在于表達(dá)特異性強(qiáng)、表達(dá)率高，因此使其成為腫瘤基因治療的理想攻擊靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)［9－10］正常口腔黏膜及皮膚不表達(dá)survivin基因，但在口腔及皮膚鱗狀細(xì)胞癌中survivin的表達(dá)率分別為56%及64%。在乳腺癌、腎癌及甲狀腺癌［11－13］中，survivin 的表達(dá)與腫瘤侵襲性相關(guān)，并可作為臨床分期的判斷標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞周期調(diào)控異常在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用早已被普遍關(guān)注，cyclinD1作為細(xì)胞周期蛋白家族中的一員被證實(shí)為原癌基因，其調(diào)節(jié)作用與抑癌基因pRb磷酸化密切相關(guān)，是通過與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物后引發(fā)pRb磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，在細(xì)胞周期進(jìn)展中起正調(diào)節(jié)作用［14］。cyclinD1過度表達(dá)在腫瘤細(xì)胞增殖中起到重要的作用［15］，Umekita 等［16］在研究乳腺癌組織 cyclinD1 的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)其與雌激素受體表達(dá)有顯著關(guān)系，陽性表達(dá)率高達(dá)42%。本研究發(fā)現(xiàn)增加EGCG的濃度能明顯抑制舌鱗癌細(xì)胞cyclinD1和survivin基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，加入Ni2+后這種調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)，說明Ni2+加劇了EGCG對(duì)細(xì)胞cyclinD1和survivin基因的調(diào)節(jié)作用，兩者共同作用比兩者單獨(dú)處理對(duì)抑制細(xì)胞的毒性作用都更加顯著，從而證實(shí)EGCG與Ni2+對(duì)細(xì)胞的增殖即cyclinD1和survivin基因的表達(dá)表現(xiàn)出了協(xié)同作用。

在許多生物素及藥物研究中發(fā)現(xiàn)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡作用的機(jī)制都是通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞中原本上升的cyclinD1和survivin基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的［17－19］。本研究中EGCG及EGCG+Ni2+均抑制了舌鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且都對(duì)細(xì)胞中cyclinD1和survivin起到了下調(diào)的作用，因而推測(cè)cyclinD1和survivin是EGCG及EGCG+Ni2+抑制細(xì)胞增殖的主要機(jī)制，但是 EGCG、EGCG+Ni2+是如何調(diào)節(jié)cyclinD1、survivin的具體途徑尚不得而知，需要深入研究其分子機(jī)制才可為口腔臨床選用合金種類提供理論依據(jù)，為牙科鑄造合金的改良研究和新型合金的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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