王曉陽(yáng),孫立榮,李珊珊,胡盼盼,郝福順

（河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南開封475004）

Cd是一種有毒重金屬,被植物吸收后可直接或間接抑制許多生理過(guò)程如呼吸作用、光合作用、細(xì)胞生長(zhǎng)、水分吸收、氮代謝和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)等,導(dǎo)致植物生長(zhǎng)量下降[1-2].Cd還可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,危害人體健康[1].過(guò)量Cd能夠?qū)е轮参锂a(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species,ROS）,導(dǎo)致氧化脅迫.同時(shí),植物中存在抗氧化酶和抗氧化劑清除過(guò)量的ROS,主要的抗氧酶有抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase,APX）、過(guò)氧化氫酶（catalase,CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase,GR）[3].

NADPH作為還原力在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)答逆境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用.NADPH主要通過(guò)磷酸戊糖途徑產(chǎn)生,另外,NAD（H）激酶（NADK）也能通過(guò)磷酸化NAD（H）形成NADPH.擬南芥基因組中存在3 個(gè) NADK 基因：NADK1（At3g21070）、NADK2（At1g21640）和 NADK3（At1g78590）[4-6].NADK1 在擬南芥應(yīng)答離子射線脅迫和氧化脅迫中起作用[4].NADK2主要在葉綠體合成和葉綠體保護(hù)中發(fā)揮作用[5].NADK3則為擬南芥應(yīng)答氧化脅迫和ABA反應(yīng)所必需[7].然而,NADK3是否參與調(diào)節(jié)Cd脅迫反應(yīng)以及具體的作用機(jī)制還不清楚.本文以野生型（WT）、NADK3純合缺失突變體nadk3和超表達(dá)NADK3的轉(zhuǎn)基因植物為材料研究發(fā)現(xiàn),NADK3通過(guò)調(diào)節(jié)擬南芥ROS水平和Cd的積累應(yīng)答Cd脅迫反應(yīng).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）T-DNA插入突變體種子nadk3（SALK_079342）購(gòu)自擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center,ABRC）,突變體和WT等種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的HgCl2表面消毒5 min,然后用無(wú)菌水洗5遍,點(diǎn)種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的瓊脂MS培養(yǎng)基上,4℃春化2～3 d,培養(yǎng)室中培養(yǎng)2周后,移苗至培養(yǎng)土中培養(yǎng),培養(yǎng)室溫度為（20±2）℃,光照強(qiáng)度為8000～16 000 lx,光暗周期為16 h/8 h,相對(duì)濕度50%左右.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NADK3表達(dá)分析及突變體表型分析 提取WT、nadk3及轉(zhuǎn)基因植株的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),以Actin2為參照分析NADK3的表達(dá),NADK3特異引物為：

Sense：5'-TTGTTTGGCAGAGTGGTTCCT-3'

Antisense：5'-CGATGTAGATAGTCCCGTGGTC-3'

將在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d左右的WT、nadk3及2個(gè)超表達(dá)株系轉(zhuǎn)移到含有CdCl2（0、50、100、150 μmol/L）的MS培養(yǎng)基上,幼苗在培養(yǎng)室豎直生長(zhǎng)14 d后測(cè)定主根長(zhǎng)并進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì).

1.2.2 根中H2O2水平測(cè)定 利用H2O2熒光探針2′,7′-二氯二氫熒光素（H2DCF-DA）檢測(cè)根中H2O2的積累[8].將MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到含50 μmol/L CdCl2的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6 h,將幼苗在10 μmol/L的H2DCF-DA中孵育10 min,用無(wú)菌水沖洗2遍,然后用激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)525 nm）測(cè)定H2O2熒光強(qiáng)度.將WT未用CdCl2處理根的平均熒光強(qiáng)度設(shè)置為100%,其他根的熒光強(qiáng)度以此為對(duì)照得到相對(duì)熒光強(qiáng)度.試驗(yàn)重復(fù)3次（n=10）.

1.2.3 抗氧化酶活性的測(cè)定 按Jiang和Zhang[9]的方法制備粗酶液.0.5 g樣品在液氮中研磨后,加入5 mL 50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）,含1 mmol/L的乙二胺四乙酸,1%聚乙烯吡咯烷酮,以15 000 r/min離心15 min,上清液為粗酶液.分裝,迅速用液氮速凍,-80℃超低溫保存.

按Nakano和Asada[10]的方法,根據(jù)290 nm處光吸收的降低確定APX活性.3 mL反應(yīng)混合液中包括含50 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）,0.5 mmol/L抗壞血酸,0.1 mmol/L H2O2和200 μL酶液,反應(yīng)時(shí)間為2 min.

按Aebi[11]的方法,根據(jù)240 nm處H2O2的降解速率測(cè)定CAT活性.3 mL反應(yīng)混合液中包括50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）,10 mmol/L H2O2和200 μL酶液.反應(yīng)時(shí)間為3 min.

按Giannopolitis和Ries[12]的方法,根據(jù)抑制氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光還原的相對(duì)百分率測(cè)定SOD的活性.3 mL反應(yīng)混合液中包括50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.8）,13 mmol/L蛋氨酸,75 μmol/L NBT,2 μmol/L核黃素,2 mmol/L Na2EDTA和100 μL粗酶液.測(cè)定560 nm的光吸收.一個(gè)酶活力單位定義為抑制50%NBT所需的酶量.

GR活性按Schaedle和Bassham[13]的方法根據(jù)340 nm處NADPH的氧化測(cè)定酶活性測(cè)定,反應(yīng)時(shí)間為3 min.3 mL反應(yīng)液中含50 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.8）,2 mmol/L Na2EDTA,0.5 mol/L氧化型谷胱甘肽和200 μL粗酶液.

1.2.4 Cd2+含量測(cè)定 將在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5 d的幼苗,轉(zhuǎn)移到含有CdCl2的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14 d,所有幼苗都用來(lái)測(cè)定Cd2+含量.用Z-2000型日立石墨爐原子吸收法測(cè)定Cd2+吸光度,然后計(jì)算出含量.取處理好的新鮮擬南芥材料,用去離子水洗3遍,然后用稱量紙包好,放在70℃烘箱烘至恒重.稱取15 mg材料,550℃灰化6 h,待冷卻至室溫后用體積分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸溶解,定容至50 mL.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體nadk3對(duì)Cd脅迫敏感

從擬南芥生物資源中心得到了T-DNA插入到NADK3外顯子的突變體SALK_079342,并通過(guò)PCR鑒定獲得了純合突變體,命名為nadk3,同時(shí)構(gòu)建了NADK3的超表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥獲得了4個(gè)超表達(dá)株系.RT-PCR結(jié)果顯示,與WT相比,nadk3中NADK3完全被敲除（見圖1（a））,4個(gè)超表達(dá)株系中有3個(gè)NADK3的表達(dá)量明顯高于WT（圖1（b））.因此,選表達(dá)量顯著增加的2個(gè)株系OE-1和OE-3進(jìn)行后續(xù)研究.如圖1（c）和1（d）所示,在正常MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí),WT、nadk3、OE-1和OE-3表型上沒有顯著差異,但在添加50 mmol/L或100 mmol/L CdCl2的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后,突變體主根明顯比WT和超表達(dá)植物短,而且,隨著CdCl2濃度的增加,Cd對(duì)突變體的抑制作用更加顯著,這說(shuō)明nadk3比WT和超表達(dá)植物對(duì)Cd脅迫更敏感.

2.2 Cd脅迫上調(diào)WT植株中NADK3基因的表達(dá)

用RT-PCR技術(shù)測(cè)定了Cd對(duì)WT幼苗中NADK3表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)50 mmol/LCdCl2處理幼苗12 h、24 h后,NADK3的表達(dá)均增加,12 h增加量最大,說(shuō)明Cd處理誘導(dǎo)了NADK3的表達(dá)結(jié)果（見圖2）.

2.3 Cd脅迫下nadk3中H2O2的增加量顯著多于WT

為了進(jìn)一步檢測(cè)H2O2在WT和突變體中的積累水平,利用H2O2熒光探針H2DCF-DA檢測(cè)了Cd脅迫下WT和nadk3幼苗根中H2O2的變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：未用CdCl2處理時(shí),WT根中H2O2含量明顯高于nadk3.Cd脅迫下,WT和nadk3根中H2O2積累均增加,而且nadk3中H2O2的水平顯著高于WT,前者相對(duì)熒光強(qiáng)度是后者的3倍,說(shuō)明NADK3的缺失導(dǎo)致Cd脅迫下擬南芥根中ROS增加（見圖3）.

2.4 鎘脅迫下nadk3中抗壞血酸過(guò)氧化物酶的活性顯著降低

為確定NADK3是否通過(guò)影響抗氧化酶的活性應(yīng)答Cd脅迫反應(yīng),檢測(cè)了Cd脅迫下突變體和WT植物中APX、CAT、SOD和GR的活性.結(jié)果顯示：Cd脅迫下WT和nadk3中APX和GR的活性均明顯降低,突變體中這2種酶活性降低的幅度顯著大于WT.用CdCl2處理后,CAT活性在WT和nadk3中都下降,SOD活性在2種植物中均增加,但CAT和SOD活性變化的幅度在2種植物中差異不顯著（見圖4）.這些結(jié)果說(shuō)明,Cd脅迫下,NADK3可能通過(guò)調(diào)節(jié)APX和GR的活性影響ROS的變化.

2.5 Cd脅迫下nadk3中Cd2+積累增加

為了研究在不同濃度Cd處理下WT和nadk3體內(nèi)Cd2+的積累情況,進(jìn)行了Cd2+含量的測(cè)定.結(jié)果見圖5.

由圖5可知,CdCl2處理后,2種植物中Cd2+的含量隨處理濃度的增高而增加,且突變體的增加量明顯高于WT,表明NADK3通過(guò)負(fù)調(diào)控Cd2+的積累在擬南芥應(yīng)答Cd脅迫反應(yīng)中起作用.

3 結(jié)論

通過(guò)分析NADK3在擬南芥應(yīng)答Cd脅迫下的作用,得到了純合突變體nadk3和NADK3轉(zhuǎn)基因超表達(dá)植物,通過(guò)表型分析發(fā)現(xiàn)NADK3在擬南芥應(yīng)答Cd脅迫反應(yīng)中具有重要作用.NADK3基因表達(dá)受Cd脅迫誘導(dǎo).Cd脅迫下,NADK3可能通過(guò)調(diào)控APX和GR的活性影響植物中ROS的變化.另外NADK3也通過(guò)影響Cd脅迫下擬南芥幼苗中Cd2+的積累調(diào)節(jié)Cd脅迫的應(yīng)答反應(yīng).

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