王 猛，李如剛，肖毅宏，邢夢(mèng)雅，雷雙舟，徐佳寧，徐 欣，趙大勇

（1.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，江蘇 南京210098；2.無(wú)錫錢(qián)惠污水處理有限公司，江蘇 無(wú)錫214151）

活性污泥是微生物群體及它們所依附的有機(jī)物質(zhì)和無(wú)機(jī)物質(zhì)的總稱，具有由多種細(xì)菌組成并通過(guò)胞外聚合物和離子橋作用形成的絮狀結(jié)構(gòu)。細(xì)菌是活性污泥組成和凈化功能的核心，也是生物法處理工業(yè)和城市生活污水的主體[1，2］。了解活性污泥中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性，使其中的微生物更好地發(fā)揮凈化作用，對(duì)于進(jìn)一步提高污水處理效率具有重要意義。

細(xì)菌群落多樣性的傳統(tǒng)研究方法是分離培養(yǎng)、顯微鏡觀察，這類(lèi)方法不足以從整體上掌握細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成以及多樣性信息。隨著分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新興的分子生物學(xué)技術(shù)如變形梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Terminal restriction fragment length polymorphism，T－RFLP）、克隆文庫(kù)等的出現(xiàn)逐漸彌補(bǔ)了這一缺陷[3］。

T－RFLP依據(jù)微生物的基因組學(xué)信息，選取一段具有系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記特征的DNA序列為分析目標(biāo)，應(yīng)用熒光物質(zhì)標(biāo)記1個(gè)或1對(duì)引物的5′端。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化處理，熒光標(biāo)記末端片段可被測(cè)序儀識(shí)別，得到不同長(zhǎng)度的末端片段峰，根據(jù)片段峰的大小和數(shù)量就可以檢測(cè)和分析環(huán)境樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和動(dòng)態(tài)變化等信息[4，5］。1997年，Liu等[6］首先應(yīng)用 T－RFLP技術(shù)研究微生物多樣性。隨后，該技術(shù)快速發(fā)展，已成為研究環(huán)境微生物多樣性的重要手段之一，與其它指紋圖譜技術(shù)相比，TRFLP具有更高的靈敏度和重復(fù)性[7］。目前，已有應(yīng)用 T－RFLP技術(shù)研究土壤[8］或活性污泥[9］中微生物多樣性的研究報(bào)道。

作者在此以不同城市生活污水處理廠曝氣池中的活性污泥樣品作為研究對(duì)象，應(yīng)用T－RFLP技術(shù)研究其中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，分析細(xì)菌群落組成與水處理工藝之間的關(guān)系，擬為提高污水處理效率提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品采集

分別從烏魯木齊、合肥、無(wú)錫和西安各選取一個(gè)大型生活污水處理廠采集活性污泥樣品，其基本信息如表1 所示。

從各污水處理廠曝氣池中采集活性污泥樣品2L，置于冰上迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。離心收集活性污泥至50 mL離心管，于－20℃保存。

1.2 樣品總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

表1 污水處理廠基本信息Tab.1 Information of different sewage treatment plants

將活性污泥樣品用真空冷凍干燥機(jī)（ALPHA1－2，德國(guó)Christ）凍干，取0.25g，利用DNA提取試劑盒（Power Soil DNA Isolation Kit，Mobio，USA）提取樣品總DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的DNA樣品，于－20℃保存。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用細(xì)菌通用引物對(duì)8f（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）和 926r （5′－CCGTCAATTCCTTTGAGTTT－3′），前者5′端采用Cy5－N－羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行熒光標(biāo)記。50μL的PCR反應(yīng)體系包括：5μL 10×PCR緩沖溶液（Ex Taq Buffer，Takara，Otsu，Japan），4 μL dNTPs，4 μL MgCl2，0.1μL上、下游引物，0.4μL Ex Taq DNA 聚合酶和1μL提取的基因組DNA，加水補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；94℃30s，53℃30s，72℃1min，循環(huán)30次；72℃7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 T－RFLP分析

首先，用綠豆酶（Mung bean nuclease）在30℃消化PCR產(chǎn)物30min。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Axygen Biotechnology Ltd.，Hangzhou，China）純化消化后的產(chǎn)物。然后，用限制性內(nèi)切酶HhaI（Takara，Otsu，Japan）37℃消化3h。消化產(chǎn)物再次純化后，用CEQ8000（Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA，USA）核酸片段分析儀對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行T－RFLP分析。進(jìn)一步分析相對(duì)豐度超過(guò)1%、長(zhǎng)度為60～600bp的TRFs片段。分別計(jì)算細(xì)菌群落的Shannon－Wiener指數(shù)（H′）、Simpson指數(shù)（D）和Pielou指數(shù)（J），以反映活性污泥樣品中細(xì)菌的多樣性。計(jì)算公式為：

式中：Pi表示峰面積占總面積的比例；S表示TRFs數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于T－RFLP的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 細(xì)菌多樣性分析

根據(jù)T－RFLP圖譜中T－RFs的數(shù)量、種類(lèi)和豐度，分別計(jì)算各樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2 。

表2 不同活性污泥樣品細(xì)菌多樣性指數(shù)Tab.2 Bacterial diversity indexes of the activated sludge samples collected from different cities

從表2 可以看出：4個(gè)活性污泥樣品的H′值、D值均有顯著的差異；而J值則沒(méi)有顯著的差異，基本穩(wěn)定在0.71～0.91之間；西安活性污泥樣品的H′值最低，表明西安活性污泥樣品中細(xì)菌多樣性最低；不同活性污泥樣品中細(xì)菌多樣性的順序?yàn)椋簽豸斈君R＞合肥＞無(wú)錫＞西安。

2.1.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)對(duì)T－RFLP數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到相對(duì)豐度圖如圖1所示。

圖1 不同活性污泥樣品中各限制性片段的相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundances of the T－RFs in the activated sludge samples collected from different cities

從圖1可以看出：長(zhǎng)度為61～100bp T－RFs的總豐度在4個(gè)活性污泥樣品中都占到50%以上。長(zhǎng)度為82bp、85bp、86bp、87bp、91bp、93bp、131bp、132bp、138bp、207bp的T－RFs在4個(gè)樣品中均有較高的相對(duì)豐度，如：長(zhǎng)度為87bp的T－RF在4個(gè)樣品中的相對(duì)豐度均超過(guò)了15%，長(zhǎng)度為86bp的T－RF在4個(gè)樣品中的相對(duì)豐度均超過(guò)了5%，可以判斷這2個(gè)片段為4個(gè)活性污泥樣品中的優(yōu)勢(shì)種群；長(zhǎng)度為62 bp的T－RF在烏魯木齊、合肥、無(wú)錫3個(gè)樣品中的相對(duì)豐度超過(guò)了5%；長(zhǎng)度為88bp、95bp、132bp的T－RFs在合肥與無(wú)錫2個(gè)樣品中的相對(duì)豐度超過(guò)了5%。

2.2 T－RFs定性推斷

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù) Microbial Community AnalysisⅢ（MiCA 3）（http：／／mica.ibest.uidaho.edu／pat.php）和Phylogenetic Assignment Tool（PAT）（http：／／secure.limnology.wisc.edu／trflp／）進(jìn)行對(duì)比，可以鑒定特定長(zhǎng)度的T－RF片段所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌的分類(lèi)地位。與PAT數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)所得到的優(yōu)勢(shì)T－RFs所代表的細(xì)菌分別屬于芽孢桿菌綱（Bacilli）、α－變形菌綱（α－Proteobacteria）、δ－變形菌綱（δ－Proteobacteria）、γ－變形菌綱（γ－Proteobacteria），如表3 所示。

表3 PAT數(shù)據(jù)庫(kù)中與主要T－RFs對(duì)應(yīng)的細(xì)菌的分類(lèi)地位Tab.3 Phylogenetic assignment of the dominant T－RFs in PAT database

從表3 可以看出：62bp、95bp、96bp、211bp的T－RFs均為厚壁菌門(mén)（Firmicutes），具有嗜鹽特性[10］，而檢索出的與其最相近的細(xì)菌類(lèi)群卻各不相同，分別為玫瑰色鹽水球菌（Salinicoccus roseus）、芽孢桿菌屬（Bacillus arsenicoselenatis）、福賽類(lèi) 擬 桿 菌 （Bacteroides forsythus）、氣球菌屬（Abiotrophia adiacens，在砷的地球化學(xué)循環(huán)中起重要作用[11］）等；82bp、86 bp、88bp的 T－RFs均為變形菌門(mén)（Proteobacteria），其相近序列分別為芽單胞菌屬（Blastomonas natatoria）、紅螺菌屬（Rhodospirillum sodomense）、生脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）；91bp、93bp的 TRFs也屬于變形菌門(mén)（Proteobacteria），卻分別屬于δ－變形 菌 綱 （δ－Proteobacteria）與 γ－變 形 菌 綱 （γ－Proteobacteria），其相近序列也分別為蛭弧菌屬（Bdellovibrio stolpii）和布赫納式菌屬（Buchnera aphidicola，與蚜蟲(chóng)共生[12］）。

3 結(jié)論

研究了4個(gè)城市生活污水處理廠活性污泥中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。通過(guò)分析4個(gè)不同來(lái)源活性污泥樣品的Shannon－Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou指數(shù)，得出4個(gè)樣品的多樣性順序?yàn)椋簽豸斈君R＞合肥＞無(wú)錫＞西安；通過(guò)分析各樣品中T－RFs的相對(duì)豐度并與PAT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，可以看出：4個(gè)活性污泥樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬于芽孢桿菌綱、α－變形菌綱、δ－變形菌綱和γ－變形菌綱；86bp、87bp的 T－RFs為4個(gè)活性污泥樣品中的優(yōu)勢(shì)種群，其中86bp的TRF屬于α－變形菌綱（α－Proteobacteria）。

[1]余彬彬，李鈞敏，金則新.分子生物學(xué)技術(shù)在活性污泥微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（5）：313－315.

[2]高平平，趙立平.可用于微生物群落分子生態(tài)學(xué)研究的活性污泥總 DNA提取方法研究[J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，22（11）：2015－2019.

[3]Theron J，Cloete T E.Molecular techniques for determining microbial diversity and community structure in natural environments[J］.Critical Reviews in Microbiology，2000，26（1）：37－57.

[4]Marsh T L.Terminal restriction fragment length polymorphism（T－RFLP）：An emerging method for characterizing diversity among homologous populations of amplification products[J］.Current Opinion in Microbiology，1999，2（3）：323－327.

[5]Kitts C L.Terminal restriction fragment patterns：A tool for comparing microbial communities and assessing community dynamics[J］.Curr Issues Intest Microbiol，2001，2（1）：17－25.

[6]Liu W T，Marsh T L，Cheng H，et a1.Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16SrRNA[J］.Applied and Environmental Microbiology，1997，63（11）：4516－4522.

[7]任南琪，趙陽(yáng)國(guó)，高崇洋，等.TRFLP在微生物群落結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)分析中的應(yīng)用[J］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，39（4）：552－556.

[8]葛蕓英，陳松，胡蘭，等.土壤細(xì)菌DNA提取及多樣性分析的TRFLP方法[J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（1）：131－136.

[9]孫慶華，柏耀輝，趙翠，等.DGGE、T－RFLP、LH－PCR對(duì)兩種活性污泥的微生物種群多樣性分析的比較[J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2009，3（8）：1365－1370.

[10]Prasad M M，Seenayya G.Shelf－life of ribbonfish （Trichiurus haumela）cured in salt with red halophlic bacteria（Salinicoccus roseus）and chemical preservatives[J］.Journal of Food Science and Technology（Mysore），2009，46（1）：41－45.

[11]洪斌.微生物對(duì)砷的地球化學(xué)行為的影響——暨地下水砷污染機(jī)制的最新研究進(jìn)展[J］.地球科學(xué)進(jìn)展，2006，21（1）：77－82.

[12]苗雪霞，丁德誠(chéng).蚜蟲(chóng)與其胞內(nèi)共生細(xì)菌的相互作用[J］.生命科學(xué)，2003，15（4）：242－247.