肖國強(qiáng), 張炯明, 邵艷卿, 柴雪良, 吳洪喜, 劉 博, 方 軍, 滕爽爽

(浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325005)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的持久性有機(jī)污染物, 主要源于有機(jī)物的熱解和石油、煤等化石燃料的燃燒, 通過地面徑流、污水排放以及大氣顆粒沉降進(jìn)入海洋環(huán)境[1]。PAHs易被懸浮顆粒物所吸附結(jié)合在沉積物中, 很難發(fā)生光化學(xué)講解或微生物氧化分解, 并且可能會(huì)重新釋放進(jìn)入到海水和生物體中對(duì)環(huán)境造成二次污染。苯并芘B[a]P是致癌性最強(qiáng)的一種 PAHs。已有研究表明[2]廈門西港表層海水中 16中 PAHs的含量, 其總濃度達(dá)到 103.4～2141.1 ng/L(B[a]P為5.5～23.4 ng/L), 而表層沉積物中PAHs的濃度在105.3～5118.3 ng/g。臺(tái)州灣[3]海洋環(huán)境中表層、中層和底層水中16種PAHs總濃度的平均值為 3440.7、3067.1和 3726.9 ng/L(B[a]P為92.15、87.31和85.66 ng/L), 沉積物中PAHs含量為85.4～167.6 ng/g(B[a]P為0.06 ng/g)。研究表明, 生物體細(xì)胞、生物化學(xué)和分子水平上的變化可以最先反映污染物的毒性作用, EROD和GST是主要檢測(cè)指標(biāo), 能夠反映細(xì)胞色素P450依賴的混合功能氧化酶活性的變化, 用于檢測(cè)多環(huán)芳烴親脂性污染物的毒性效應(yīng); 而MDA是膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一, 其含量的高低可以指示生物膜受氧化損傷的程度[4-5]。

雙殼貝類與其他海洋生物相比, 具有分布廣、富集能力強(qiáng)、采樣和檢測(cè)較容易等優(yōu)點(diǎn), 更重要的是其體內(nèi)有機(jī)污染物水平能夠較準(zhǔn)確地反應(yīng)出環(huán)境中的污染水平, 被廣泛地應(yīng)用于海洋環(huán)境中有機(jī)污染物的檢測(cè), 如全球性的“Mussel Watch”計(jì)劃。目前, 一些學(xué)者開展了 B[a]P對(duì)貝類毒理學(xué)的研究,但是主要集中在牡蠣、貽貝和扇貝[6-8], 對(duì)營(yíng)埋棲生活的灘涂貝類卻未見報(bào)道。本文研究了B[a]P對(duì)代表性灘涂貝類泥蚶(Tegillarca granosa)的脅迫和釋放2個(gè)階段, 泥蚶消化盲囊和鰓絲EROD、GST活性和脂質(zhì)過氧化物(MDA含量)的變化規(guī)律, 探討EROD,GST和MDA作為泥蚶解毒代謝指標(biāo)的可行性, 為灘涂貝類的健康養(yǎng)殖和養(yǎng)殖環(huán)境 PAHS污染監(jiān)測(cè)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用泥蚶取自溫嶺市樂海水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)(國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系浙江綜合試驗(yàn)站核心示范區(qū)),平均殼長(zhǎng)(3.2±0.13)cm。實(shí)驗(yàn)在浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江基地開展, 實(shí)驗(yàn)開始前暫養(yǎng)7 d, 實(shí)驗(yàn)用海水為二級(jí)砂濾海水, 海水鹽度 21～24, pH為7.9～8.1, 溫度為(25±2)℃, 連續(xù)充氣, 日換水100%, 每天早晚投喂適量的金藻或者角毛藻, 暫養(yǎng)密度為400個(gè)/m3。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

B[a]P脅迫濃度梯度設(shè)置為0.05、0.5、5和10μg/L,實(shí)驗(yàn)用B[a]P購自Sigma公司, 采用丙酮作為助溶劑配置成B[a]P儲(chǔ)備液, 實(shí)驗(yàn)用時(shí)分別用砂濾海水配置成各濃度梯度, 以自然海水組為對(duì)照, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度均設(shè)3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)組丙酮的濃度小于 0.005 %,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 自然海水組和含有 0.005%的丙酮實(shí)驗(yàn)組, 泥蚶的解毒代謝酶活力無顯著差異。

實(shí)驗(yàn)在30 cm×40 cm×50 cm的塑料水槽內(nèi)進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)水體為 50 L, 每個(gè)水槽放入活力好, 無損傷的泥蚶45只, 實(shí)驗(yàn)期間的養(yǎng)殖管理和暫養(yǎng)期間完全相同, 換水時(shí)分別加入對(duì)應(yīng)各梯度的海水。實(shí)驗(yàn)分為然脅迫階段15 d和清除階段15 d, 實(shí)驗(yàn)開始后分別于0、1、5、10、15、20、25、30 d 取樣, 每個(gè)平行隨機(jī)取3只泥蚶個(gè)體, 分別取消化盲囊和鰓絲, 用預(yù)冷雙蒸水洗凈、濾紙吸干后, 置于1.5 mL離心管中, 保存于-80℃超低溫冰箱中待測(cè)。

1.3 樣品制備

將泥蚶消化盲囊和鰓絲分別置于預(yù)冷磷酸緩沖液(pH=7.6)和Tri-HCI緩沖液中(0.1 mmol的EDTA,pH=8.3), 冰浴12 000 r/min勻漿3 min, 將勻漿液3 000 r/min 離心20 min(4℃), 上清液即為待測(cè)酶液。

1.4 酶活性測(cè)定

EROD活性參照 Pohl[9]改進(jìn)的快速終止熒光分光光度法, 活力單位用每分鐘每毫克蛋白產(chǎn)生的異吩唑酮(resorufin)相對(duì)量的多少來表示, 單位:nmol/(min·mg)prot); 谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)和脂質(zhì)過氧化物含量 LPO采用試劑盒測(cè)定(購自南京建成生物工程研究所), GST通過催化還原型胱甘肽(GSH)與 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)結(jié)合的能力, 通過檢測(cè) GSH 濃度的高低反映 GST活力的大小, 單位:nmol/(min·mg); LPO含量通過檢測(cè)MDA含量的變化, 定義為每毫克組織蛋白中所含有丙二醛的質(zhì)量, 單位: (nmol/mg); 蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析, 數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Means ± SD)表示, 并用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 以P＜0.05 為顯著性差異, 以P＜0.01 為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 B[a]P對(duì)泥蚶組織EROD活力的影響

圖1可看出, 泥蚶消化盲囊和鰓絲低濃度組(0.05 μg/L)EROD 活力隨時(shí)間變化不明顯(P＞0.05),其他各處理組EROD活性均被誘導(dǎo), 其中0.5μg/L處理組 EROD活性與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05),而5μg/L和10μg/L處理組與對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0.01), 5 d后達(dá)到峰值并處于穩(wěn)定。在清除階段,0.5μg/L處理組5 d后與對(duì)照組無顯著差異, 而5μg/L和10μg/L處理組10 d無顯著差異。

2.2 B[a]P對(duì)泥蚶組織GST活力的影響

泥蚶消化盲囊和鰓絲GST活力的變化如圖2所示, 呈逐漸下降趨勢(shì), 5 d后基本趨于穩(wěn)定, 除低濃度組(0.05 μg/L)與對(duì)照物無明顯差異, 其他處理組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。清除階段 0.5 μg/L處理組5 d即與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05), 而5 μg/L和10 μg/L處理組10 d時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。

2.3 B[a]P對(duì)泥蚶組織LPO水平的影響

B[a]P染毒和清除階段, 泥蚶消化盲囊和鰓絲MDA含量的變化如圖3所示。MDA含量隨時(shí)間呈上升趨勢(shì), 在染毒1 d后, 除低濃度組(0.05 μg/L)外,各處理組MDA含量與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05), 并在第10 d基本達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定。清除5 d后, 5 μg/L處理組鰓絲和10 μg/L仍顯著高于對(duì)照組, 清除10 d后,各處理組與對(duì)照組無顯著差異。

3 討論

3.1 B[a]P對(duì)泥蚶組織EROD, GST活力和MDA含量的影響

許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)一些魚類受到 PAHs的影響,能夠明顯誘導(dǎo)EROD的活力, EROD活力越大, 污染物的毒性效應(yīng)越高[10-12]。研究表明, 青鳉的 EROD活力能夠被PAHs顯著誘導(dǎo), 可以作為污染監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物[13], 黑鯛的肝臟的 EROD活力也與 B[a]P濃度呈較好的線性關(guān)系[14]。本研究中, 低濃度處理組(0.05μg/L)EROD活力變化不大, 而在5 μg/L和10 μg/L處理組EROD活力則被極顯著誘導(dǎo)(P＜0.01), 5 d后趨于穩(wěn)定, 表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系, 但是有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期暴露在大劑量的 PAHs的環(huán)境中, 會(huì)破壞CYP1A的結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致EROD的活性下降[15]。本實(shí)驗(yàn)中在清除階段EROD活力在5～10 d即恢復(fù)到了對(duì)照組水平, 表明B[a]P對(duì)泥蚶造成的損傷可以可逆的,未超出生物體的自我修復(fù)能力。鰓絲的EROD活力小于消化盲囊, 可能是由于B[a]P在鰓絲積累程度和敏感度均較低。

圖1 不同濃度B[a]P對(duì)泥蚶組織EROD活力的影響Fig. 1 Effect of B[a]P on EROD activities of tissues in Tegillarca granosa

研究表明,PAHs進(jìn)入生物體經(jīng)過I相代謝, 形成的中間產(chǎn)物可產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)[16], GST是 II相代謝抗氧化酶的代表成分可催化中間代謝物的結(jié)合, 使之形成水溶物排出機(jī)體外。一些研究表明[17-18]生物受到PAHs脅迫時(shí), GST活力在低劑量短時(shí)間內(nèi)會(huì)被誘導(dǎo), 但是長(zhǎng)時(shí)間或者高劑量的脅迫下會(huì)呈下降趨勢(shì), 表現(xiàn)出一定的時(shí)間效應(yīng)和劑量, 通過一定時(shí)間的清除能夠恢復(fù)對(duì)照組水平。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看, 除低濃度組(0.05 μg/L)與對(duì)照物無明顯差異, 其他處理組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。清除階段0.5 μg/L處理組5 d即與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05),而5 μg/L和10 μg/L處理組10 d時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平, 這與上述結(jié)果基本一致, 但是各處理組未表現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的變化趨勢(shì), 作者認(rèn)為可能泥蚶對(duì)B[a]P的脅迫響應(yīng)較為迅速, 短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出被誘導(dǎo)效應(yīng)(小于24 h)。通過清除恢復(fù)處理, 各實(shí)驗(yàn)組5～10 d即恢復(fù)正常水平, 有些生物需要15～20 d, 才能完全恢復(fù)到正常水平, 雖然不同生物對(duì)PAHs脅迫的響應(yīng)略有差別, 但均能有效的反應(yīng)生物受脅迫, 解毒和恢復(fù)的過程。

本實(shí)驗(yàn)的高濃度處理組MDA含量隨時(shí)間一直呈上升趨勢(shì), 在10 d后基本達(dá)到了峰值, 這表明泥蚶受到B[a]P的脅迫后, GST活力和抗氧化酶系統(tǒng)活力下降, 不能被及時(shí)清除的活性氧物質(zhì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的損傷, 泥蚶處于中毒狀態(tài)。清除5～10 d后各處理組與對(duì)照無顯著差異, 這與楊濤研究苯并(b)熒蒽對(duì)翡翠貽貝的脅迫結(jié)果相似[7]。

圖2 不同濃度B[a]P對(duì)泥蚶組織GST活力的影響Fig. 2 Effect of B[a]P on GST activities of tissues in Tegillarca granosa

3.2 EROD, GST和MDA作為泥蚶解毒代謝指標(biāo)的探討

本實(shí)驗(yàn)中無論是 B[a]P的脅迫階段還是清除階段, 泥蚶組織中EROD、GST和MDA含量都表現(xiàn)出很強(qiáng)的規(guī)律性。高濃度處理組 EROD活力和 MDA含量隨著濃度的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),但是在5～10 d左右會(huì)達(dá)到峰值, 而GST活力則明顯被抑制, 5 d達(dá)到最低值, 均具有一定的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。這種效應(yīng)關(guān)系在Huang Zhouying[19]利用B[a]P和TBT對(duì)蛤的脅迫研究, Kristine[20]利用B[a]P 2種鯰魚的脅迫研究, 任加云[18]利用苯并(a)芘和苯并(k)熒蒽混合物對(duì)櫛孔扇貝的脅迫研究中得到了驗(yàn)證。研究表明, 生物在污染物的脅迫下, 組織細(xì)胞中的褐脂質(zhì)小粒和過氧化物酶體密度變大, 從而導(dǎo)致EROD活力升高[21]。本實(shí)驗(yàn) 5 μg/L和 10 μg/L處理組 5 d后 EROD活力達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定, 這表明EROD活力被誘導(dǎo)達(dá)到極限, 而XU Wenju[22]研究表明,超高劑量菲(Phe 100～400μg/L)長(zhǎng)時(shí)間脅迫羅非魚(4 d以上)會(huì)導(dǎo)致EROD活力誘導(dǎo)后被抑制, 泥蚶是否會(huì)在超高劑量的脅迫下EROD活力出現(xiàn)誘導(dǎo)后被抑制有待進(jìn)一步認(rèn)證。

GST活力受到抑制表明, 當(dāng)機(jī)體受到重度脅迫,產(chǎn)生的氧化壓力超過機(jī)體的調(diào)節(jié)能力時(shí), 此時(shí)不能被及時(shí)清除的活性氧物質(zhì)就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的損傷, 抗氧化酶活力可能會(huì)下降[23], 需氧生物的細(xì)胞膜磷脂分子不斷受到氧化壓力的攻擊, 導(dǎo)致膜和脂質(zhì)的過氧化。通過測(cè)定MDA含量能夠有效評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化的程度, 比較準(zhǔn)確的反映PHAs對(duì)生物體的脅迫和自我解毒作用。

本研究選擇的EROD, GST和MDA表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性, 并且在海洋無脊椎動(dòng)物的抗氧化防御系統(tǒng)已廣泛用作污染檢測(cè)的指標(biāo)[24-25]。但是泥蚶作為灘涂貝類的典型代表, 主要營(yíng)埋棲生活, 不僅受海水中PHAs的影響, 可能還受到海洋沉積物中PHAs的影響, 因此要綜合考慮兩方面的因素進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

圖3 不同濃度B[a]P對(duì)泥蚶組織MDA含量的影響Fig. 3 Effect of B[a]P on MDA content of tissues in Tegillarca granosa

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