孫 妍, 黃曉婷, 胡麗萍, 王 師, 王春德, 包振民

(1.海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003; 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島266109)

海灣扇貝(Argopecten irradians, Lamarck, 1819)原產(chǎn)于北美洲大西洋沿岸, 于 1982年引入中國[1],由于其生長迅速而受到養(yǎng)殖戶歡迎, 目前已成為中國重要的海水養(yǎng)殖貝類之一[2-3]。但是, 由于引種個(gè)體數(shù)目較少, 隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大, 遺傳多樣性降低, 近交衰退現(xiàn)象顯著, 種質(zhì)資源的退化需要引種復(fù)壯和遺傳育種工作的不斷進(jìn)行, 對(duì)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅[4-5]。與海灣扇貝同屬的紫扇貝(A. purpuratus,Lamarck, 1819), 是原產(chǎn)于南太平洋的速生型中型扇貝, 主要在智力北部和秘魯沿岸進(jìn)行規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖[6], 具有體型大、生長速度快、壽命長等優(yōu)點(diǎn)。

雜交在改善海洋貝類種質(zhì)資源中有許多成功的應(yīng)用[3,7], 通過雜交育種的方式, 有望豐富現(xiàn)有扇貝種質(zhì)資源并產(chǎn)生優(yōu)于親本生產(chǎn)性狀的雜種優(yōu)勢(shì)。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)王春德教授于2008年將紫扇貝引入中國,并開展了紫扇貝與海灣扇貝的雜交育種工作, 獲得了雜交子一代成體[8], 在生長率、成活率上優(yōu)于親本,與海灣扇貝相比, 雜交子代成貝總質(zhì)量增加125.9%～138.9%, 肉柱重增加 145.4%～156.2%, 具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)[9]。在紫扇貝和海灣扇貝的雜交中,親本雙方在雜交育種中的貢獻(xiàn)率大小、種間雜交子代與種內(nèi)交配子代遺傳上的差異、以及雜種優(yōu)勢(shì)的遺傳基礎(chǔ)等問題都需要我們對(duì)雜種及其親本的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

本研究應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù), 對(duì)紫扇貝、海灣扇貝、正交子一代(紫扇貝♀×海灣扇貝♂)及反交子一代(海灣扇貝♀×紫扇貝♂)群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析, 從分子水平探討雜交子代的遺傳組成, 同時(shí)為雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的闡述提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用紫扇貝(PP)、海灣扇貝(II)及其正反雜交后代(紫扇貝♀×海灣扇貝♂, PI; 海灣扇貝♀×紫扇貝♂, IP)均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)王春德教授提供,其中紫扇貝為秘魯引進(jìn)種, 海灣扇貝取自青島膠南市, 雜交實(shí)驗(yàn)及雜種培育參見Wang等[9]的方法。

1.2 方法

基因組 DNA的提取采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組DNA[10]。AFLP分析參照Vos等[11]的方法,引物及接頭序列參照潘潔等[12], 由上海生物工程合成, 序列見表1。選擇性擴(kuò)增用4種EcoR I引物和3種Mse I引物, 共5對(duì)組合引物組合: E-AAC/M- CAG、E-AAC/M-CCA、E-AAG/M-CCA、E-ACA/M- CTG、E-ATC/M-CTG。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)4.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳后, 進(jìn)行銀染顯帶。

表1 AFLP分析中所用的接頭及引物序列Tab. 1 The adapter and primer sequence used in AFLP analysis

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析銀染之后得到的帶譜應(yīng)用Cross checker 2.8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 有帶記為1, 無帶記為 0, 獲得 1、0矩陣。統(tǒng)計(jì)各群體擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)數(shù)。用Pop Gene32軟件計(jì)算群體內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)比率、Nei’ s基因多樣性、香農(nóng)氏多樣性指數(shù)和群體間遺傳相似度及遺傳距離。為評(píng)估遺傳變異來源于群體內(nèi)還是群體間, 用Arlequin3.11進(jìn)行分子方差分析(Analysis of Molecularof Variance, AMOVA), 計(jì)算群體間變異來源和遺傳分化指數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 AFLP 擴(kuò)增帶譜分析

本研究用 E-AAC/M-CAG、E-AAC/M-CCA、E-AAG/M-CCA、E-ACA/M-CTG、E-ATC/M-CTG五對(duì)引物組合, 在紫扇貝(PP)、海灣扇貝(II)及其正反雜交子代(PI和IP)4個(gè)群體中共得到了433個(gè)位點(diǎn),平均每對(duì)引物得到86.6個(gè)位點(diǎn)。

AFLP在親本和雜交后代 4個(gè)群體中的擴(kuò)增帶譜可以分為4種, 如圖1: (I)雙親和正反雜交子代均有的擴(kuò)增位點(diǎn), 這種位點(diǎn)共有 169個(gè), 占總位點(diǎn)數(shù)的 39.03%; (II)親本一方與雜交子代共享位點(diǎn),其中, 紫扇貝與正反交子代共享的位點(diǎn)數(shù)為 82個(gè),海灣扇貝與雜交子代共享的位點(diǎn)數(shù)為 181個(gè); (III)在親本中出現(xiàn), 而雜交子代中丟失的位點(diǎn), 統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn), 紫扇貝和海灣扇貝各有30和18個(gè)位點(diǎn)在子代中丟失; (Ⅳ)非親位點(diǎn), 即親本中沒有, 而雜交子代中出現(xiàn)的位點(diǎn), 這類位點(diǎn)共有 12個(gè)(正交子代中5個(gè)、反交子代中 8個(gè))。由此可見, 正反交子代97.23%擴(kuò)增得到的位點(diǎn)來源于紫扇貝和海灣扇貝,且來源于海灣扇貝的位點(diǎn)數(shù)多于來源于紫扇貝的位點(diǎn)數(shù)。本研究在分子水平上證實(shí)了雜交扇貝成貝的雜種身份。

圖1 紫扇貝、海灣扇貝及雜交子代AFLP選擇性擴(kuò)增結(jié)果—E33M54Fig. 1 Polyacrylamide gel electrophoresis result of selective amplification

2.2 紫扇貝(PP)、海灣扇貝(II)及其正反雜交子一代(PI和IP)的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

4個(gè)群體的多態(tài)位點(diǎn)比率、Nei’ s基因多樣性、香農(nóng)氏指數(shù)見表 2。4個(gè)群體中, 紫扇貝(PP)群體的遺傳多樣性最低; 海灣扇貝(II)群體最高。雜交子代群體的遺傳多樣性介于兩親本之間, 且反交群體高于正交群體。紫扇貝群體內(nèi)遺傳多樣性較低可能是由于目前引種數(shù)目較少引起的。

表2 4個(gè)群體內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)Tab. 2 Genetic diversityparameters withinfour groups

從群體間的遺傳距離(表 3)可以看出, 兩個(gè)親本(PP和II)間的遺傳距離為0.5464, 正反雜交F1代與兩親本的遺傳距離為 0.2186～0.2701, 表明兩個(gè)親本間、子代與親本間的遺傳差異較大。而正反交F1代間遺傳距離小, 遺傳相似度高, 表明正反交子代無群體分化。此外, 正反雜交F1代與母本的遺傳距離均比與父本的遺傳距離小, 表明雜交子代一定程度偏向母本, 從母本獲得的遺傳信息可能要多于從父本獲得的遺傳信息。

表3 4個(gè)群體間的遺傳相似性和遺傳距離Tab. 3 Genetic distances and similarities between four groups

應(yīng)用分子方差分析(AMOVA)對(duì)4個(gè)群體兩兩間的遺傳多樣性來源進(jìn)行分析(表 4), 兩親本群體間遺傳差異最大, 兩親本間和親本與雜交子代間遺傳分化顯著; 正反雜交子代間遺傳差異最小, 沒有明顯的遺傳分化。

表4 4個(gè)群體總遺傳變異來源及遺傳分化指數(shù)Tab. 4 The source of variation and Fstabout four scallop groups

3 討論

紫扇貝與海灣扇貝同屬于海灣扇貝屬(Argopecten), 進(jìn)化關(guān)系較近, 是當(dāng)今世界上兩種重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖扇貝[13]。雖然紫扇貝在生產(chǎn)上做出了相當(dāng)大的貢獻(xiàn), 但針對(duì)其分子生物學(xué)的研究很少, 基因組信息相對(duì)于其他經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖扇貝而言十分有限。AFLP標(biāo)記對(duì)基因組的信息背景沒有要求, 通過改變限制性內(nèi)切酶和選擇性堿基的種類與數(shù)目,可產(chǎn)生大量的理論上可以覆蓋整個(gè)基因組標(biāo)記數(shù)目,該標(biāo)記還具有豐富的多態(tài)性, 對(duì)遺傳關(guān)系相近的材料也可達(dá)到較強(qiáng)的多態(tài)分辨能力。本研究選用AFLP分子標(biāo)記技術(shù), 能夠從基因組的水平對(duì)紫扇貝、海灣扇貝及其正反雜交F1代4個(gè)群體之間的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析, 從而確證雜交子代的遺傳組成, 并為研究雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生提供可能的遺傳基礎(chǔ)。

雜交作為一種改良生產(chǎn)性狀的重要途徑, 在海洋養(yǎng)殖扇貝的育種工作已有很多報(bào)道。扇貝種內(nèi)不同地理種群之間雜交的研究較多也較為成熟, 常亞青和劉小林對(duì)櫛孔扇貝中國種群與日本種群及與俄羅斯群體的雜交組合的研究表明, 雜交后代表現(xiàn)出了不同程度的雜交優(yōu)勢(shì)[14-15]。種間雜交方面, 國內(nèi)在櫛孔扇貝(Chlamys farreri)、海灣扇貝(A. irradians irradians)、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)和華貴櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis)等不同種間雜交已經(jīng)開展了很多工作[16-18]。但是, 種間雜交由于親本間遺傳差異較大, 常出現(xiàn)雜交不親和、幼體不成活等“遠(yuǎn)緣雜交綜合征”, 導(dǎo)致在許多貝類的種間雜交中出現(xiàn)低幼蟲孵化率、幼蟲低成活率和高胚胎畸形率的現(xiàn)象[17,19]。僅在楊愛國等開展的櫛孔扇貝與蝦夷扇貝雜交研究中, 獲得的雜交子一代, 并在抗逆性能方面明顯優(yōu)于親貝, 而通過細(xì)胞遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 該兩種扇貝的雜種身份在幼蟲時(shí)期是可以證實(shí)的, 在幼蟲發(fā)育過程中染色體組成上發(fā)生了一定的變異,成體時(shí)期的雜種身份仍需驗(yàn)證[20-21]。王春德等[8-9]于2007和2008年將紫扇貝引進(jìn)中國, 并開展了紫扇貝和海灣扇貝種間雜交研究, 成功獲得了雜交扇貝成體, 且雜交扇貝表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢(shì), 這在已有的扇貝雜交育種研究當(dāng)中是鮮有報(bào)道的, 借助細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)手段, 作者已經(jīng)證明雜種子代的確由雙親的遺傳物質(zhì)組成, 證明的雜交一代的雜種身份[22]。

為了進(jìn)一步了解雜種子代的遺傳組成, 本研究應(yīng)用 AFLP技術(shù)對(duì)紫扇貝、海灣扇貝及正反雜交子代的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析, 計(jì)算出兩親本遺傳距離0.5464, 遺傳分化指數(shù)Fst為0.77。Nei[23]估計(jì)亞種間的遺傳距離值約為 0.02～0.20; 種間遺傳距離的變幅為 0.10～2.00, Wright[24]提出,Fst＞0.25 說明群體間的遺傳分化很大。由此可見, 本研究中兩親本扇貝群體遺傳分化顯著, 屬于兩個(gè)不同的物種, 它們的雜交屬于種間雜交。但是扇貝種間雜交子代, 尤其是雜交成貝, 可能有復(fù)雜的遺傳組成。本研究對(duì)雜交子代遺傳結(jié)構(gòu)的分析表明, 正反交子代中的位點(diǎn)大部分來源于紫扇貝和海灣扇貝, 來源于海灣扇貝的擴(kuò)增位點(diǎn)略多于來源于紫扇貝的擴(kuò)增位點(diǎn), 原因可能是海灣扇貝群體的遺傳多樣性高于紫扇貝; 此外,正反交F1與雙親的Fst指數(shù)都＞0.25, 表明分化顯著,且F1與雙親的遺傳相似度和遺傳距離顯示其為介于雙親間的中間種; 雖然雜交子代與紫扇貝和海灣扇貝的遺傳關(guān)系上并不完全對(duì)等, 略偏向于母本一方,但并不表現(xiàn)出明顯的傾向性。本研究結(jié)果為紫扇貝和海灣扇貝種間雜交子代的遺傳組成提供了分子水平的證據(jù)。

紫扇貝和海灣扇貝雜交獲得的子代, 與海灣扇貝相比, 雜交子代成貝總質(zhì)量增加了 125.9%～138.9%,肉柱質(zhì)量增加了 145.4%～156.2%, 具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)[9]。雜種優(yōu)勢(shì)作為生物界普遍存在的現(xiàn)象, 在改良生產(chǎn)性狀和種質(zhì)品質(zhì)中得到了廣泛的應(yīng)用, 但其理論基礎(chǔ)的研究卻相對(duì)薄弱, 理論研究的滯后也制約其在生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。因此, 雜種優(yōu)勢(shì)的遺傳機(jī)理研究一直是近百年來遺傳和育種學(xué)家研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。早在 20世紀(jì)初, Bruce[25]和 Shull[26]就基于單基因遺傳效應(yīng)相繼提出了雜種優(yōu)勢(shì)的顯性假說和超顯性假說。隨著研究手段的改進(jìn)和研究?jī)?nèi)容的深入, 認(rèn)為雜種優(yōu)勢(shì)的遺傳實(shí)質(zhì)應(yīng)是各種基因效應(yīng)的綜合,特別是上位效應(yīng)和連鎖效應(yīng)在雜種優(yōu)勢(shì)遺傳基礎(chǔ)中將占有重要地位。雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)包括貝類在內(nèi)的海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物進(jìn)行遺傳改良研究和應(yīng)用的歷史較短, 關(guān)于其雜種優(yōu)勢(shì)遺傳機(jī)理的研究報(bào)道也很少[27]。AFLP作為一種顯性標(biāo)記應(yīng)用于紫海雜交貝的遺傳結(jié)構(gòu)分析, 可以為海洋貝類雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的機(jī)理的探討提供一定的線索。在雜交過程中子代出現(xiàn)了非親遺傳的位點(diǎn), 這些位點(diǎn)的產(chǎn)生可能是由于親本雙方的同源染色體相互作用對(duì)酶切位點(diǎn)引起的修飾或隱蔽, 或者個(gè)別酶切位點(diǎn)附近堿基突變等, 這些雜交子代中出現(xiàn)的種種非孟德爾遺傳變化可能與其在生產(chǎn)上表現(xiàn)出的雜種優(yōu)勢(shì)有一定關(guān)系, 需要進(jìn)一步深入研究加以證實(shí)。

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