王 哲，王 普，黃 金

（浙江工業(yè)大學(xué)生物制藥研究所，浙江 杭州 310014）

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一種甘油酯水解酶，屬α/β折疊水解酶類。它廣泛存在于動物、植物和微生物細(xì)胞中。脂肪酶不僅可在油水兩相界面催化天然底物甘油酯的水解，還可在疏水介質(zhì)中催化酯化、轉(zhuǎn)酯化、酯交換等反應(yīng)。由于脂肪酶具有反應(yīng)活性高、立體選擇性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，使其在食品、皮革、造紙、有機(jī)合成、油脂化工、洗滌劑、化妝品、醫(yī)藥以及生物柴油合成等諸多領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。近年來，有關(guān)脂肪酶催化機(jī)理研究已逐漸引起人們的關(guān)注。脂肪酶有別于酯酶、蛋白酶等其它α/β折疊水解酶的最顯著特征在于它的催化活性中心部位被一個或多個α-螺旋片段遮蓋（稱為“蓋子”結(jié)構(gòu)）。這種特殊結(jié)構(gòu)使得當(dāng)環(huán)境中存在油水兩相界面時，蓋子結(jié)構(gòu)打開，從而暴露出脂肪酶催化活性中心，發(fā)揮其催化功能（在行使催化功能時，脂肪酶的催化活性中心三元組中的組氨酸（His）從絲氨酸（Ser）上吸收一個質(zhì)子，使得Ser親核攻擊羰基上的碳原子，形成特殊的脂肪酶-底物復(fù)合物的四面體過渡態(tài) TS（tetrahedral transition state）（見圖1）。在整個過程中天冬氨酸（Asp）通過與組氨酸（His）形成氫鍵起到穩(wěn)定組氨酸位置的作用）。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)、生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，利用分子模擬技術(shù)研究脂肪酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在催化過程中的動態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而理解其反應(yīng)機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系，最終實(shí)現(xiàn)對脂肪酶的理性設(shè)計(jì)與改造已引起眾多學(xué)者濃厚的研究興趣[1-2]。分子模擬技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程大致可分為3個階段：早期的皮秒（ps）級別的分子動力學(xué)模擬；柔性的分子對接技術(shù)；運(yùn)算時間更長的分子動力學(xué)模擬以及 QM/MM（quantum mechanics/molecular mechanics，量子力學(xué)/分子力學(xué)）。

1 早期的分子動力學(xué)模擬

分子動力學(xué)模擬技術(shù)[3]主要依靠牛頓力學(xué)來模擬分子體系的運(yùn)動，從而獲得生物大分子在已知最低能量構(gòu)象附近一系列合理的空間構(gòu)象。因此，早期關(guān)于脂肪酶分子動力學(xué)模擬技術(shù)主要是用于脂肪酶構(gòu)象變化的研究。Norin等[4]于1994年通過分子動力學(xué)方法比較了米黑根毛霉脂肪酶（Rhizomucor mieheilipase，RmL）在真空、水溶液和非極性溶液等不同溶劑條件下的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)RmL 在非極性有機(jī)溶劑中比水相中的剛性更強(qiáng)，并且依據(jù)在乙酸乙酯溶劑中的動力學(xué)模擬，揭示出RmL 蓋子結(jié)構(gòu)的關(guān)閉與打開狀態(tài)。Peters等[5]1996年研究多種溶劑對RmL結(jié)構(gòu)的影響時也得出類似的結(jié)論。Zuegg等[6]于1997年運(yùn)用分子動力學(xué)模擬方法研究了褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosalipase，CrL）和洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacialipase，PcL）兩種脂肪酶催化水解伯醇酯和仲醇酯的四面體過渡態(tài)構(gòu)象差異，提出了“大小口袋”規(guī)則（見圖2），并依據(jù)該規(guī)則揭示了脂肪酶催化上述兩種酯水解的對映體選擇性機(jī)理。由于受到當(dāng)時計(jì)算機(jī)的運(yùn)算速度所限，整個分子動力學(xué)模擬過程僅運(yùn)行了15 ps。

2 柔性分子對接技術(shù)預(yù)測脂肪酶的對映體選擇性及催化機(jī)理

分子對接技術(shù)是通過幾何匹配、能量匹配和化學(xué)環(huán)境匹配來尋找復(fù)合物的最優(yōu)狀態(tài)[7]。各種分子對接方法的計(jì)算體系均存在不同程度的簡化。根據(jù)簡化的程度和方式不同，可將分子對接方法分為剛性對接、半柔性對接和全柔性對接，其中，剛性對接主要用于蛋白-蛋白對接。隨著分子對接技術(shù)的發(fā)展，人們開始運(yùn)用半柔性或全柔性的對接技術(shù)研究脂肪酶對底物的對映體選擇性。Tafi等[8]將全柔性對接技術(shù)應(yīng)用于定性預(yù)測脂肪酶水解反應(yīng)的對映體選擇性研究，通過分子對接打分以及復(fù)合物的幾何構(gòu)象是否符合脂肪酶過渡態(tài)構(gòu)象來判斷立體選擇性的優(yōu)劣（見圖3）。

柔性分子對接技術(shù)具有快速預(yù)測脂肪酶在催化過程中的立體選擇性的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于脂肪酶對底物選擇性的高通量虛擬篩選[9-13]。Tyagi等[9]通過對分子對接打分，預(yù)測了6種脂肪酶水解12種底物的能力（見表1），但由于僅依據(jù)對接打分來進(jìn)行預(yù)測，其評價(jià)體系過于單一且導(dǎo)致預(yù)測結(jié)果并不理想，需要進(jìn)一步結(jié)合復(fù)合物幾何構(gòu)象等因素綜合判斷對接結(jié)果。Xu等[10]通過設(shè)計(jì)南極假絲酵母脂肪酶（Candida antarcticalipase B，CaLB）催化底物四面體過渡態(tài)的幾何構(gòu)象來定性預(yù)測該脂肪酶對底物的對映體選擇性。經(jīng)驗(yàn)證，233個化合物中有 223個化合物被正確識別，預(yù)測準(zhǔn)確率高達(dá)95.7%。分子對接技術(shù)作為一種簡單快速的計(jì)算機(jī)模擬手段應(yīng)用于定性預(yù)測脂肪酶催化立體選擇性的研究已有較多報(bào)道，但其計(jì)算精確度不高，不能全面地闡述脂肪酶的催化機(jī)理。因此分子對接方法多被用于模擬初始的復(fù)合物構(gòu)象，再結(jié)合運(yùn)用其它手段，如定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）、分子動力學(xué)和QM/MM 等方法，進(jìn)一步研究其催化機(jī)理。

3 長運(yùn)算時間的分子動力學(xué)模擬、QM/MM 方法及QSAR方法

隨著計(jì)算機(jī)運(yùn)算能力的發(fā)展，分子動力學(xué)方法由最初只能計(jì)算皮秒（ps）級別的分子運(yùn)動，逐漸發(fā)展到納秒（ns）級、甚至是微秒（μs）級。在此期間，人們利用分子動力學(xué)方法研究脂肪酶性質(zhì)及催化機(jī)理的報(bào)道逐漸增多，且預(yù)測結(jié)果也越來越精準(zhǔn)。

表1 6種脂肪酶水解12種底物的對接打分

已報(bào)道的將分子動力學(xué)應(yīng)用于脂肪酶性質(zhì)和機(jī)理研究涉及以下4個方面。①在不同溶劑中的脂肪酶構(gòu)象變化。Rahman等[14]研究洋蔥伯克氏細(xì)菌脂肪酶（Burkholderiacepacialipase）在水-辛烷兩相混合溶劑體系中構(gòu)象變化時發(fā)現(xiàn)，在水環(huán)境中脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)處于閉合狀態(tài)，而當(dāng)辛烷分子接近“蓋子”時，脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)打開，且“蓋子”打開的幅度與溫度有關(guān)，溫度越高，打開幅度越大。Wedberg等[15]采用分子動力學(xué)方法考察了 5種水-有機(jī)溶劑混合體系對南極假絲酵母脂肪酶 B（Candida antarcticalipase B）氨基酸殘基柔性的影響，得到了類似的結(jié)論。②不同 pH 值條件下的酶結(jié)構(gòu)變化。James等[16]將褶皺假絲酵母脂肪酶（Candida rugosalipase）分別置于pH值為5.6和7.2的水溶液中，并進(jìn)行了2 ns的分子動力學(xué)模擬，結(jié)果表明：中性pH值條件下脂肪酶“蓋子”區(qū)的柔性更強(qiáng)，底物更容易進(jìn)入活性中心區(qū)域，因而反應(yīng)速率更快。③研究脂肪酶與底物間的作用機(jī)制和選擇性機(jī)理[17-20]。Raza等[18]基于分子動力學(xué)方法，并通過計(jì)算南極假絲酵母脂肪酶 B（Candida antarcticalipase B）與底物形成四面體過渡態(tài)后的結(jié)合自由能，較好地預(yù)測了其對映體選擇性。Xu等[19]在研究南極假絲酵母脂肪酶 B與底物的過渡態(tài)相互作用過程中發(fā)現(xiàn)了幾種非常規(guī)的復(fù)合物結(jié)合模式（見圖4）。④對脂肪酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行理性的設(shè)計(jì)和改造[1，21]。Park等[1]基于分子動力學(xué)方法比較了南極假絲酵母脂肪酶B經(jīng)定點(diǎn)突變前后在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，并找到了該脂肪酶中3個可以提高其在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性的關(guān)鍵殘基。

對于脂肪酶催化反應(yīng)來說，首先脂肪酶通過“界面激活”效應(yīng)打開蓋子結(jié)構(gòu)，暴露出催化活性位點(diǎn)，隨后底物進(jìn)入活性區(qū)域，與脂肪酶形成四面體過渡態(tài)，進(jìn)而完成催化反應(yīng)。分子動力學(xué)模擬雖然是通過大量的原子運(yùn)動來優(yōu)化整個體系，但并沒有考慮時間維度，而是把大量動力學(xué)模擬產(chǎn)生的構(gòu)象進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到合理的平均構(gòu)象。因而，它無法描述化學(xué)鍵的形成與斷裂。

要研究脂肪酶過渡態(tài)的成鍵過程，必須使用量子力學(xué)的方法，但由于運(yùn)算量受到限制，人們尚無法對整個體系進(jìn)行量子力學(xué)計(jì)算。為解決這一難題，Warshel等[22]于 1974年首次提出了量子力學(xué)/分子力學(xué)（quantum mechanics/molecular mechanics，QM/MM）方法，該方法將整個催化體系分為兩部分，即精確的量子力學(xué)（quantum mechanics，QM）部分和快速的分子力學(xué)（molecular mechanics，MM）部分（見圖5），采用局部的量子力學(xué)研究酶與底物的成鍵問題，其它理論研究則使用分子力學(xué)方法。使用QM/MM方法在一定程度上回避了量子力學(xué)計(jì)算量過大的問題。眾多研究者運(yùn)用QM/MM方法針對多種脂肪酶的催化機(jī)理開展了更加深入的研究[2，23-26]（見表 2）。

值得關(guān)注的是，近年來人們基于另一種分子模擬方法，即定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure activity relationships，QSAR）來精確預(yù)測脂肪酶的對映體選擇性，且預(yù)測值與理論值的相關(guān)性非常理想（R2＞ 0.9）[27-28]。QSAR，是運(yùn)用書寫模型來描述分子結(jié)構(gòu)與分子某種生物活性之間的關(guān)系。基本假設(shè)是化合物的結(jié)構(gòu)包含了其物理、化學(xué)以及生物信息，進(jìn)而決定了該化合物的性質(zhì)。該方法通過對少量底物的某種生物活性的實(shí)際測定，便可直接預(yù)測其它同系物的活性。這種方法雖然預(yù)測的準(zhǔn)確率高，但僅對同系物有效，其適用性不強(qiáng)。

4 存在問題與展望

綜上所述，分子對接技術(shù)具有快速得到脂肪酶與底物復(fù)合物的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于高通量預(yù)測脂肪酶對底物的選擇性研究，計(jì)算簡單，但準(zhǔn)確性較差。而分子動力學(xué)方法更接近于真實(shí)環(huán)境，準(zhǔn)確度較高，但其采用的點(diǎn)電荷模型具有不可極化現(xiàn)象和計(jì)算過程中無法形成或斷開共價(jià)鍵等缺點(diǎn)。QM/MM方法通過局部的量子力學(xué)計(jì)算，解決了分子動力學(xué)方法無法成鍵的問題，在脂肪酶催化機(jī)理研究方面顯示出較大優(yōu)勢。目前分子動力學(xué)和QM/MM方法仍然存在運(yùn)算速度慢、預(yù)測精確度較差的問題。而QSAR方法雖然預(yù)測精確度高，但僅局限于同系物。

表2 QM/MM的方法研究脂肪酶催化機(jī)理

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，分子模擬技術(shù)在酶的性質(zhì)及催化機(jī)理研究方面的應(yīng)用將越來越廣泛。單一模擬方法已無法滿足研究的需要，聯(lián)合運(yùn)用多種模擬手段已成為現(xiàn)今研究的主流。當(dāng)計(jì)算機(jī)的運(yùn)算能力逐步提升到不再成為制約模擬方法的關(guān)鍵因素時，根據(jù)從頭計(jì)算的分子動力學(xué)方法預(yù)測脂肪酶的空間結(jié)構(gòu)、全量子力學(xué)研究脂肪酶的催化機(jī)理以及新的更加精確的力場，如可極化力場下的分子動力學(xué)等將更精確、更接近于真實(shí)環(huán)境，分子模擬技術(shù)將發(fā)揮出更加重要的作用。

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