郝 瑤，劉曉芹，蔡志芳，郭滿棟

（山西師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾041004）

生物傳感器具有分析速度快、選擇性高及制備成本低等優(yōu)點，成為世界科技發(fā)展的新熱點［1－2］.目前國內(nèi)外對血紅蛋白的研究主要集中于血紅蛋白的聚合［3］、電化學(xué)中的應(yīng)用［4－5］及對血紅蛋白結(jié)構(gòu)［6］、輸氧功能［7］和在電子轉(zhuǎn)移機理方面［8］的探討.在電化學(xué)方面，血紅蛋白常被用作修飾物來制備生物傳感器，并以制作簡單、廉價易得等優(yōu)點得到了大力發(fā)展［9－11］.

鐵氰化鈰（CeHCF）膜修飾電極具有良好的電化學(xué)活性、高度穩(wěn)定性及制備簡便等優(yōu)點［12］.實驗中鐵氰化鈰膜為血紅蛋白提供了一個新的固載體，從而實現(xiàn)了血紅蛋白在電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移，并對過氧化氫產(chǎn)生催化氧化作用.目前，國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報道有關(guān)該電極的制備及應(yīng)用［13－14］，但是尚未見到鐵氰化鈰膜固載血紅蛋白用作生物傳感器的報道.實驗采用電化學(xué)沉積法制備CeHCF／GCE，然后將血紅蛋白固載于CeHCF修飾電極上，制備出一種新型過氧化氫生物傳感器.研究表明，該傳感器對H2O2有較好的電化學(xué)響應(yīng)，且靈敏度較高，具有創(chuàng)新性和實用性.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LK2005A型電化學(xué)工作站（天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司），KQ－250B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），JSM－7500F掃描電子顯微鏡（日本電子），BS124S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），W－103微量進(jìn)樣器5.0μL（上海醫(yī)用微量儀器廠），PXSJ－216型離子計（雷磁，上海精密科學(xué)儀器有限公司）.實驗采用三電極系統(tǒng)：鉑絲電極為輔助電極，Ag／AgCl（KCl，飽和）為參比電極，血紅蛋白／鐵氰化鈰修飾玻碳電極和裸玻碳電極（d＝2mm）為工作電極.

牛血紅蛋白（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），配置濃度為5.0g／L，置于冰箱（4℃）儲存.Ce（NO3）3·6H2O（北京劉李店福利化工廠），使用時配置濃度為1.5×10－2mol／L，4℃避光保存.KCl（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），K3［Fe（CN）6］（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），使用時分別配置濃度為1.5×10－2mol／L.過氧化氫（30%，洛陽市化學(xué)試劑廠），實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水，所有實驗均在室溫下進(jìn)行.

1.2 修飾電極的制備過程

1.2.1 基體玻碳電極的預(yù)處理

將玻碳電極用Al2O3粉打磨，依次用二次蒸餾水、HNO3（體積比是1∶1）、丙酮、二次蒸餾水分別超聲清洗，晾干.在0.5mol／L的H2SO4溶液中對玻碳電極進(jìn)行電化學(xué)活化，活化后取出電極用二次水沖洗，室溫晾干.

1.2.2 儲備液的制備

血紅蛋白（Hemoglobin from bovine blood，Hb）儲備液：稱取50mg牛血紅蛋白，用二次水溶解，并定容至10mL容量瓶中，4℃下避光保存.

Ce（NO3）3（1.5×10－2mol／L）儲備液：稱取0.325 7g Ce（NO3）3·6H2O，用二次水溶解，并定容至50 mL容量瓶中，4℃下避光保存.

K3［Fe（CN）6］（1.5×10－2mol／L）儲備液：稱取0.246 9g K3［Fe（CN）6］，溶解并稀釋定容至50mL容量瓶中，4℃下避光保存.

KCl（1.5mol／L）儲備液：稱取5.591 3g KCl，溶解并稀釋定容至50mL容量瓶中，4℃下避光保存.

1.2.3 CeHCF／GCE電極的制備

將經(jīng)預(yù)處理活化后的基體玻碳電極浸入到盛有電解液2mL 1.5×10－2mol／L Ce（NO3）3、2mL 1.5×10－2mol／L K3［Fe（CN）6］和2mL 1.5mol／L KCl的電解池中，通入氮氣，在－0.1V～1.0V電位范圍內(nèi)，以100mV／s的掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安掃描40圈.從圖1的掃描中，觀察到當(dāng)電極電位從－0.1V向＋1.0 V掃描時，于605mV處出現(xiàn)一個氧化峰，對應(yīng)溶液中的Fe（CN被氧化生成Fe（CN；電極電位向負(fù)方向掃描時，于305mV處出現(xiàn)還原峰，對應(yīng)溶液中的Fe（CN被還原生成Fe（CN.隨著掃描次數(shù)的增加，氧化還原峰的峰電流逐漸減小，說明在玻碳電極表面已經(jīng)形成了CeHCF膜.CeHCF膜電化學(xué)形成機理如下：由于Fe（CN得到電子形成Fe（CN－，同時溶液中Ce3＋迅速與Fe（CN結(jié)合形成CeHCF，并沉積到玻碳電極表面，形成了CeHCF膜修飾電極.掃描完成后，將電極取出，可以觀察到在電極表面形成了一層不透明的膜.將其用二次蒸餾水沖洗，室溫晾干備用.實驗前，在加入電解液的電解池中，先通氮氣10 min.且整個實驗過程一直保持氮氣氛圍.其電極表面的成膜機理可能為：

1.2.4 Hb／CeHCF／GCE電極的制備

用微量進(jìn)樣器量取2μL 5.0g／L Hb溶液，將其均勻滴涂于已修飾好的CeHCF／GCE電極表面，室溫下晾干，12h后使用.電極不用時儲存于4℃冰箱中.

1.3 實驗方法

實驗采用三電極系統(tǒng)，以裸玻碳電極、CeHCF／GCE及 Hb／CeHCF／GCE為工作電極，Ag／AgCl（飽和 KCl）為參比電極，鉑絲電極為輔助電極.以pH＝6.4的Na2HPO4－NaH2PO4溶液為緩沖溶液，在－0.8～1.0V的電位范圍內(nèi)以100mV／s的掃速對H2O2進(jìn)行循環(huán)伏安、線性伏安及交流阻抗測定.

圖1 CeHCF膜的電沉積循環(huán)伏安曲線Fig.1 CeHCF film electrochemical polymerization of cyclic voltammetry curves

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的表征

圖2a是鐵氰化鈰膜修飾電極的掃描電鏡圖.從圖可知，鐵氰化鈰呈晶狀成功的沉積在了玻碳電極表面.從Hb／CeHCF／GCE修飾電極的掃描電鏡圖（圖2b）可知，鐵氰化鈰很好的將血紅蛋白固載在了電極表面，圖中顆粒細(xì)致均勻、排布緊密，并且存在明顯的空穴現(xiàn)象，說明鐵氰化鈰是一種很好的血紅蛋白吸附固定化材料.

圖2 CeHCF／GCE（a）和 Hb／CeHCF／GCE（b）的SEM 圖Fig.2 SEM image of CeHCF／GCE（a）and Hb／CeHCF／GCE（b）

實驗運用交流阻抗法對電極表面的修飾過程進(jìn)一步表征.圖3所示曲線a為裸玻碳電極在被測溶液中的阻抗圖，近似一條直線，電極表面沒有阻礙電子傳遞的物質(zhì).曲線b為鐵氰化鈰膜修飾玻碳電極，其表面電阻明顯大于裸玻碳電極.當(dāng)CeHCF／GCE表面吸附血紅蛋白后，其表面電阻又迅速減?。ㄇ€c），說明血紅蛋白成功的固載到了電極表面.

圖3 裸玻碳電極（a），CeHCF／GCE（b），Hb／CeHCF／GCE（c）的電化學(xué)阻抗圖Fig.3 Electrochemical impedance diagram of glassy carbon electrode（a），CeHCF／GCE（b），Hb／CeHCF／GCE（c）

2.2 Hb／CeHCF／GCE電極的電化學(xué)響應(yīng)

圖4為裸玻碳電極（a）、CeHCF／GCE電極（b）、Hb／CeHCF／GCE電極（c）在含有1.0×10－6mol／L H2O2的pH＝6.4的Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖.從曲線a可知，H2O2在裸玻碳電極上未出現(xiàn)氧化還原峰，說明裸玻碳電極對其沒有電化學(xué)響應(yīng).從曲線b、c觀察到，CeHCF／GCE電極在0.187 V處出現(xiàn)了一電化學(xué)響應(yīng)較低的還原峰Ipc＝24.226μA，氧化峰電流很小到幾乎看不出；而Hb／CeHCF／GCE電極在0.049V處出現(xiàn)了一較高的還原峰Ipc＝48.245μA，在0.447V處出現(xiàn)了一較明顯的氧化峰Ipa＝－29.682μA.由圖可知，H2O2生物傳感器在Hb／CeHCF／GCE電極上的還原峰電流要比在CeHCF／GCE電極上的還原峰電流增加1.99倍.說明鐵氰化鈰固載血紅蛋白能夠很好地增強H2O2生物傳感器的電化學(xué)響應(yīng).

由圖5可知，Hb／CeHCF／GCE電極在空白緩沖溶液中未出現(xiàn)氧化還原峰，而在含有1.0×10－6mol／L H2O2的緩沖溶液中出現(xiàn)了靈敏度較高的氧化還原峰.這說明過氧化氫生物傳感器在Hb／CeHCF／GCE電極上發(fā)生了氧化還原反應(yīng)，Hb／CeHCF／GCE電極對過氧化氫產(chǎn)生了催化作用.其氧化峰電位Epa＝0.444 V，還原峰電位Epc＝0.037V，峰間距為ΔE＝Epa－Epc＝0.407V，Ipc／Ipa＝1.625≠1，由此可知，H2O2生物傳感器在Hb／CeHCF／GCE電極上的反應(yīng)過程是不可逆過程.

圖4 電極在緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of the electrodes in buffer solution

圖5 Hb／CeHCF／GCE電極在緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.5 Cyclic voltammograms of Hb／CeHCF／GCE in buffer solution

2.3 Hb／CeHCF／GCE電極測試最佳條件的選擇

2.3.1 緩沖溶液的選擇

實驗研究了 H2O2分別在 KCl－HCl（pH＝1.6）、NaAc－HAc（pH＝5.0）、KH2PO4－硼砂（pH＝6.4）、Na2HPO4－NaH2PO4（pH＝6.4）、硼砂－HCl（pH＝8.8）、硼砂－NaOH（pH＝10.0）緩沖溶液中的電化學(xué)行為.研究表明，H2O2在Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液中的峰電流最高，所以選擇Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液作為實驗的底液.

2.3.2 pH 的選擇

研究了H2O2生物傳感器在Hb／CeHCF／GCE電極上不同酸度對響應(yīng)電流的影響.如圖6所示，當(dāng)5.8≤pH≤6.4時，響應(yīng)電流隨著pH值的增大而呈線性上升趨勢；當(dāng)pH在6.4～7.4范圍之內(nèi)時，溶液的酸度對響應(yīng)電流影響不大，峰電流較穩(wěn)定，表明在此范圍內(nèi)Hb能夠保持較好、較穩(wěn)定的電化學(xué)活性；當(dāng)pH≥7.4時，峰電流隨著pH值的增大而上升.為了保持血紅蛋白較好的活性，且考慮到人體血液中血紅蛋白的生理條件（pH＝6.0～8.5），因此，選擇pH＝6.4的Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液作為本實驗最適pH.

2.3.3 pH對峰電位的影響

采用循環(huán)伏安法研究了不同pH的Na2HPO4－NaH2PO4緩沖溶液對峰電位的影響.在pH＝5.8～7.8的緩沖溶液中，隨著pH的增加，還原峰電位逐漸向負(fù)方向移動，表明有質(zhì)子參與反應(yīng)過程.還原峰電位E0′與pH呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：

E0′－pH直線的斜率為－68.7mV／pH，接近該條件下（25℃）理論能斯特斜率－59.0mV／pH，故Hb／CeHCF／GCE電極反應(yīng)過程是等電子伴隨等質(zhì)子參加的不可逆過程.

2.3.4 掃描速率的影響

圖7是H2O2在生物傳感器Hb／CeHCF／GCE電極上的不同掃描速率下的循環(huán)伏安圖.如圖所示，隨著掃描速率v的增加，還原峰電流和氧化峰電流均不斷增大，還原峰P1逐漸負(fù)移，氧化峰P2逐漸正移.掃速在40～160mV／s范圍內(nèi)，氧化還原峰電流均與掃速v成正比，說明H2O2生物傳感器在Hb／CeHCF／GCE上的電極反應(yīng)過程主要受表面吸附控制.其線性方程分別為：

圖6 Hb／CeHCF／GCE電極上峰電流與pH的關(guān)系圖Fig.6 The plot of redox peak currents vs pH on Hb／CeHCF／GCE

圖7 Hb／CeHCF／GCE電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.7 Cyclic voltammograms of Hb／CeHCF／GCE

2.3.5 電極反應(yīng)中電子數(shù)的測定

掃描速率在40～160mV／s的范圍內(nèi)，氧化峰電位與掃速對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，E－lgv的線性方程為：

E－lgv直線斜率為0.030 6，截距為0.561 2.從E－lgv直線斜率［0.5×2.303RT×（anF）－1］可得，an＝0.987，取a＝0.5，即可計算出n≈2；由此可知，H2O2在生物傳感器 Hb／CeHCF／GCE電極上發(fā)生了兩電子交換的氧化反應(yīng).

還原峰在掃描速率40～160mV／s的范圍內(nèi)，E－lgv的線性方程為：

同上根據(jù)E－lgv直線斜率［0.5×2.303RT×（anF）－1］可得，an＝1.052，取a＝0.5，即可計算出n≈2；由此可知，H2O2在生物傳感器Hb／CeHCF／GCE電極上發(fā)生了兩電子交換的還原反應(yīng).

2.3.6 電極反應(yīng)機理的探討

CeHCF薄膜為血紅蛋白提供了一個具有親和性的溫和的吸附固載環(huán)境，并高度保持了血紅蛋白的生物活性，使血紅蛋白能夠滲透進(jìn)入到CeHCF薄膜中，而且Hb／CeHCF／GC修飾電極表觀形貌的空穴現(xiàn)象清晰可見，更加有利于離子的進(jìn)出，并使電活性中心更加靠近電極表面，從而很好的實現(xiàn)了血紅蛋白在電極上的直接電子轉(zhuǎn)移.血紅蛋白對過氧化氫有催化氧化的作用，電極在進(jìn)行陽極化掃描時，溶液中過氧化氫因失電子而產(chǎn)生氧氣，同時伴隨著質(zhì)子的產(chǎn)生；進(jìn)行陰極化掃描時，氧氣因得到電子而轉(zhuǎn)化為氫氧根離子，其反應(yīng)機理如下：

2.4 Hb／CeHCF／GCE電極的響應(yīng)性能

2.4.1 線性范圍

實驗配置了一系列不同濃度的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用循環(huán)伏安掃描法對其進(jìn)行測定.如圖8所示，隨著H2O2濃度不斷增大，氧化峰電流逐漸增大.H2O2的氧化峰電流與 H2O2濃度在1.5×10－3mol／L～4.5×10－6mol／L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程為：

檢出限為2.5×10－7mol／L（S／N＝3），說明此方法對 H2O2的檢測靈敏度較高.

2.4.2 共存離子干擾實驗

實驗對共存時可能會產(chǎn)生干擾的離子進(jìn)行了測定.在上述最優(yōu)的實驗條件下，當(dāng) H2O2濃度為5.0×10－5mol／L時，分別加入以下物質(zhì)：10倍的抗壞血酸、亮氨酸、賴氨酸、尿酸，20倍的葡萄糖、乙酸、甲酸、L－半胱氨酸、天冬氨酸，測定它們對H2O2生物傳感器響應(yīng)信號的干擾.結(jié)果表明，上述離子對H2O2的測定無明顯干擾.

2.4.3 Hb／CeHCF／GCE修飾電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

將所制得的Hb／CeHCF／GCE修飾電極儲存在4℃下，放置兩個星期后，再對H2O2進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)峰電流和峰電位基本保持不變.放置一個月后，再次測定，電極響應(yīng)性能能夠保持在初始電極響應(yīng)性能的85%左右，說明Hb／CeHCF／GCE具有較好的穩(wěn)定性和電化學(xué)活性.

在最佳的實驗條件下，制備4根Hb／CeHCF／GCE電極，對1.5×10－6mol／L H2O2溶液進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.73%，說明Hb／CeHCF／GCE電極有較好的重現(xiàn)性.

2.4.4 米式常數(shù)（Km）的計算

米式常數(shù)是表征酶促反應(yīng)的一個重要的動力學(xué)參數(shù)，是衡量酶對底物親和力大小的一個標(biāo)準(zhǔn).以H2O2濃度的倒數(shù)和穩(wěn)態(tài)電流的倒數(shù)作圖，得一直線可知其截距和斜率，即可求得米式常數(shù).根據(jù)Lineweaver－Burk方程：

式中Iss為穩(wěn)態(tài)電流（μA），Imax為測定底物時的最大電流（μA）；c為相應(yīng)底物的濃度（mol／L）.作Lineweaver－Burk圖，得線性方程為：1／Iss＝0.003 9／c＋0.083 0，r＝0.993 7；斜率為0.003 9，截距為0.083 0，從而求得最大電流Imax為12.048μA，Km為0.047mmol·L－1.Km越小，酶與底物之間親和力越大，此值表明血紅蛋白對H2O2有較高的生物活性.

2.4.5 回收率的測定

選取pH＝6.4的Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液為測試底液，分別向底液中加入4種不同濃度的H2O2溶液，并將H2O2傳感器置于含有H2O2的樣品溶液中，測定其響應(yīng)電流的變化值.結(jié)果表明，H2O2傳感器有較好的回收率（99.7%～105.9%），如下表所示.

圖8 不同濃度的H2O2的線性掃描伏安圖Fig.8 Linear sweep voltammograms of Hb／CeHCF／GCE

表1 H2O2傳感器回收率的測定Table 1 The determination of H2O2sensor recovery

3 結(jié)論

實驗采用電沉積法制備了一種新型的過氧化氫生物傳感器，并對電極反應(yīng)機理進(jìn)行了探討，結(jié)果表明鐵氰化鈰膜不僅能保持血紅蛋白的生物活性，且鐵氰化物具有良好的離子交換性能，通過其空穴效應(yīng)實現(xiàn)了血紅蛋白與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移.實驗對Hb／CeHCF／GCE修飾電極制備過程中的條件進(jìn)行了優(yōu)化，表明該修飾電極具有制備方法簡便，電流響應(yīng)快，線性范圍寬，檢測下限低等優(yōu)點，對生物醫(yī)學(xué)和臨床檢驗具有重要意義.

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