夏東琴，何玉財，譚春偉，龔 磊，龔 婷，嚴生虎，張 躍，王利群

（1常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究室，江蘇 常州 213164；2吉化集團公司研究試驗廠，吉林 吉林132021）

隨著化石資源的逐漸枯竭，利用纖維素等可再生資源生產(chǎn)生物能源的研究越來越受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。地球上的纖維素資源非常豐富，有效地利用纖維素資源對人類面臨的能源危機有現(xiàn)實意義。然而，纖維素原料具有較高的結(jié)晶度，且分子內(nèi)與分子間存在大量的氫鍵，因此難被纖維素酶糖化，為了使纖維素原料高效地糖化，必須使用合適的方法將其進行預(yù)處理[1]。許多方法用于纖維素的預(yù)處理[1-3]。目前，N-甲基嗎啉-N-氧化物（NMMO）作為高效的預(yù)處理溶劑可有效地溶解纖維素原料，如微晶纖維素和甘蔗渣[4-7]。研究表明，NMMO能溶解纖維素是由于N—O鍵的高極性，可破壞纖維素的氫鍵網(wǎng)絡(luò)并且與溶質(zhì)形成新的氫鍵，進而可預(yù)處理纖維素原料。但由于在纖維素中N—O鍵的高極性，NMMO的存在可能抑制纖維素酶的活性[5]。因此，篩選耐NMMO的高活性纖維素酶具有重要的現(xiàn)實意義。

本實驗在常規(guī)篩選方法的基礎(chǔ)上，利用富集培養(yǎng)技術(shù)[8]在富集培養(yǎng)基中加入10 g/L NMMO施加環(huán)境壓力，篩選得到一株耐NMMO的高酶活菌株，鑒定其為地霉菌Galactomycessp.，進一步對其產(chǎn)纖維素酶條件進行優(yōu)化，并利用發(fā)酵優(yōu)化后得到的發(fā)酵上清液進行糖化實驗，表明Galactomycessp.纖維素酶具有良好的耐 NMMO性能及應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土樣：采集于常州武進農(nóng)村秸稈、稻草堆放處的腐殖性土壤。

甘蔗渣組分（質(zhì)量分數(shù)）：纖維素34.9%，半纖維素28.4%，木質(zhì)素19.5%，其它組分17.2%。

富集培養(yǎng)基——羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH=5.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗渣 5 g/L，NaCl 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Tween-80 8 g/L，pH=5.5。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min后使用。

1.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

將采集的土樣稀釋1000倍，涂布于加入10 g/L NMMO的CMC-Na固體培養(yǎng)基表面，在30 ℃恒溫富集培養(yǎng)5天后，用1 g/L的剛果紅染色液浸染10 min，再用1 mol/L的NaCl溶液脫色5 min，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值大小選取活性菌落，并用牙簽點植到加有NMMO的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行產(chǎn)酶發(fā)酵試驗，用DNS測定酶活，篩選耐NMMO的高活力產(chǎn)纖維素酶菌株。

1.3 纖維素酶活力的測定

1.3.1 粗酶液的制備

將篩選得到的菌株接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng)3 天，以1%（體積比）的接種量轉(zhuǎn)接到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 天，然后在4 ℃、8000 r/min離心10 min，收集發(fā)酵上清液為粗酶液。

1.3.2 內(nèi)切型β-1,4-葡聚糖酶（CMCase）活力測定

在50 mL錐形瓶中加入2 mL酶液，稱取0.04 g CMC-Na加入到錐形瓶中，再加入8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 值為4.8，0.05 mol/L）配制成10 mL的反應(yīng)體系。將錐形瓶放入到50 ℃和160 r/min的恒溫搖床中反應(yīng)1 h。取樣400 μL，離心取上清液，進行產(chǎn)物分析。

1.3.3 濾紙酶活（FPA）活力測定

在50 mL錐形瓶中加入2 mL酶液，將1×6 cm的濾紙加入到錐形瓶中，再加入8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH值為4.8，0.05 mol/L）配制成10 mL的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件和測定同上。

1.4 纖維素酶酶活

纖維素酶酶活定義：一個酶活單位（international unit，IU）定義為在上述條件下，1min水解纖維素產(chǎn)生l μmol還原糖（以葡萄糖為準）所需的酶量[8]。

1.5 分析方法

1.5.1 DNS法

DNS溶液中的3,5-二硝基水楊酸溶液與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物。在過量的氫氧化鈉堿性溶液中，此化合物呈橘紅色，在520 nm波長處有最大吸收，在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光的吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。取100 μL反應(yīng)液和1.5 mL的3,5-二硝基水楊酸于試管中，另外取蒸餾水代替反應(yīng)液作對照。沸水浴5 min，然后加入5 mL蒸餾水，混勻，用紫外分光光度計[尤尼柯UV-2100，尤尼柯（上海）儀器有限公司]測OD520。

1.6 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

分別考察培養(yǎng)基成份（碳源、氮源和表面活性劑）和培養(yǎng)條件（初始pH值、溫度等）對酶活的影響，以纖維素酶酶活FPA和CMCase為檢測指標。

1.7 發(fā)酵上清液糖化甘蔗渣

（1）加NMMO體系中的糖化進程 在50 mL小錐形瓶中加入1.7 g NMMO、300 μL蒸餾水和7 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液，再加入2 mL發(fā)酵液、1 g/L的甘蔗渣，于50 ℃、160 r/min搖床中反應(yīng)。

（2）不加 NMMO體系中的糖化進程 在 50 mL小錐形瓶中加入8 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液，再加入2 mL發(fā)酵液、1 g/L的甘蔗渣，于50 ℃、160 r/min搖床中反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)酶微生物的篩選

通過初篩和復(fù)篩，從480份土壤中篩選到活性較高的菌株9株，研究發(fā)現(xiàn)編號CCZU11-1的菌株具有最高的纖維素酶活性。經(jīng)ITS rDNA鑒定[8]，該菌是地霉菌屬Galactomycessp.，命名為Galactomycessp. CCZU11-1，已保藏于中國微生物保藏中心，編號為CGMCC 5561。

圖1 CCZU11-1進化樹

2.2 發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 碳源、氮源的影響

培養(yǎng)基碳源組成明顯影響纖維素酶酶活。采用250 mL的三角瓶，裝液量為100 mL，各種碳源分別添加到無碳源培養(yǎng)基[KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 1 g/L，(NH4)2SO45 g/L，pH=5.0]中，其終濃度為5 g/L，不同碳源（葡萄糖、稻草、濾紙、甘蔗渣和CMC-Na等）對Galactomycessp.CCZU11-1菌株纖維素酶酶活的影響如圖2所示。由圖2可知，以葡萄糖、CMC-Na、濾紙和稻草分別作為碳源獲得的纖維素酶活性偏低，甘蔗渣能明顯地提高Galactomycessp. CCZU11-1的CMC酶活。因此，碳源采用5 g/L甘蔗渣。

氮源也是一種重要的營養(yǎng)成分。采用 250 mL的三角瓶，裝液量為100 mL，各種氮源[(NH4)2SO4、NH4Cl、蛋白胨、酵母浸出液和牛肉膏]分別添加到無氮培養(yǎng)基（甘蔗渣5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 1 g/L，pH=5.0）中，其終濃度為5 g/L，結(jié)果如圖3所示。這5種氮源對酶活均有影響，當以硫酸銨為氮源時，酶活最高，其次是氯化銨，以酵母浸出液為氮源時，體現(xiàn)的酶活較低，可能酵母膏對產(chǎn)酶有抑制作用。對于含有銨根離子的硫酸銨和氯化銨等無機氮源實驗組來說，物質(zhì)本身屬于生理酸性物質(zhì)，并且銨根離子可以直接被菌株同化為自身的氨基酸和蛋白質(zhì)，是一類速效性氮源（相對于蛋白質(zhì)這類遲效性氮源而言），有利于菌株生長，從而也促進了代謝產(chǎn)物的形成。文獻報道硫酸銨也為綠色木霉 AS3.3711和突變黑曲霉的最適氮源[9-10]。綜合考慮，本研究采用5 g/L硫酸銨為最適氮源。

圖2 碳源對纖維素酶酶活的影響

圖3 氮源對纖維素酶酶活的影響

2.2.2 培養(yǎng)溫度、初始pH值及培養(yǎng)時間的影響

培養(yǎng)溫度、初始pH值及培養(yǎng)時間對纖維素酶的活性起著重要的作用。25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃用于考察培養(yǎng)溫度對纖維素酶酶活的影響。如圖4（a）所示，在pH值為5的條件下，溫度為30℃時菌體酶活較高，因此，最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。pH值為4.0～6.5時考察培養(yǎng)基初始pH值對菌體酶活的影響。如圖4（b）所示，在溫度30 ℃條件下，pH值為5.5時菌體產(chǎn)酶酶活較高，因此，pH值為5.5是Galactomycessp. CCZU11-1最適培養(yǎng)初始pH值。

圖4 溫度和pH值對纖維素酶酶活的影響

圖5 培養(yǎng)時間對纖維素酶酶活的影響

在最適培養(yǎng)碳源、氮源、溫度和pH值條件下進行Galactomycessp. CCZU11-1的培養(yǎng)，在培養(yǎng)5～9天后取樣進行活性分析。如圖5可知，隨著發(fā)酵時間的增加，培養(yǎng)至7天時，F(xiàn)PA和CMCase達到最高值為11.3 IU/mL和18.2 IU/mL，然后逐漸降低，可能是酶蛋白被菌體自身分泌的蛋白酶降解所致[11]。所以，綜合考慮，Galactomycessp. CCZU11-1最適產(chǎn)酶培養(yǎng)時間為7天。

2.3 Tween-80對酶活的影響

表面活性劑可增加細胞膜的通透性，減少酶在膜上的吸附量，進而提高胞外酶的產(chǎn)量。許多文獻報道表面活性劑 Tween-80可作為添加劑提高纖維素酶活力[8-10，12]。本研究將不同質(zhì)量比的Tween-80添加到100 mL優(yōu)化的培養(yǎng)基中，研究Tween-80添加量對地霉菌產(chǎn)纖維素酶的影響。實驗結(jié)果如圖6所示，添加表面活性劑 Tween-80能提高纖維素酶活力，當加入量在0～8 g/L時，酶活增強，添加量為8 g/L時CMCase達到最大值24.6 IU/mL；當加入量超過8 g/L時，酶活急劇下降；添加量為10 g/L時CMCase活力為19.0 IU/mL，可能由于表面活性劑加入過多會引起蛋白質(zhì)變性，進而使酶活力降低。因此，添加表面活性劑Tween-80為8 g/L。

在優(yōu)化培養(yǎng)基體系中培養(yǎng)CCZU11-1 2 天后，分別加入0～200 g/L的NMMO，繼續(xù)培養(yǎng)到7 天，結(jié)果如圖7所示。由圖7可見，未添加NMMO體系（空白對照）中，F(xiàn)PA和CMCase分別為13.5 IU/mL和24.6 IU/mL。在添加10 g/L和50 g/L的NMMO體系中，F(xiàn)PA分別為 10.5 IU/mL和 8.3 IU/mL，CMCase分別為19.5 IU/mL和16.2 IU/mL。很明顯，Galactomycessp. CCZU11-1對NMMO具有較高的耐受性，含高濃度NMMO（200 g/L）的培養(yǎng)體系中，F(xiàn)PA和CMCase仍能保持明顯的活性。目前，少有報道具有耐NMMO的纖維素酶產(chǎn)生菌，而本研究首次報道了篩選獲得的Galactomycessp. CCZU11-1及其纖維素酶具有較高的NMMO耐受性。

2.3 發(fā)酵液糖化甘蔗渣進程

圖6 不同濃度的Tween-80的纖維素酶酶活

圖7 不同濃度NMMO對纖維素酶酶活的影響

圖8 發(fā)酵液糖化甘蔗渣進程

如圖8所示，分別在含200 g/L NMMO和不含NMMO的體系中，利用發(fā)酵液糖化甘蔗渣，還原糖濃度分別為0.60 g/L和0.63 g/L。在200 g/L NMMO存在條件下，Galactomycessp. CCZU11-1纖維素酶仍保持較好的活性及糖化率，表明Galactomycessp.CCZU11-1纖維素酶具有較好的NMMO耐受性，可在 NMMO-緩沖溶液體系中實現(xiàn)纖維素原料的原位酶解。

3 結(jié) 論

在常規(guī)篩選纖維素酶方法的基礎(chǔ)上，在富集培養(yǎng)基中加入10 g/L NMMO，從土壤中篩選獲得一株耐NMMO的高活性纖維素酶菌株Galactomycessp.CCZU11-1。經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，最終獲得了最適產(chǎn)酶培養(yǎng)條件。另外，分別在有NMMO和無NMMO的體系中糖化甘蔗渣，結(jié)果表明Galactomycessp.CCZU11-1纖維素酶對NMMO具有較好的耐受性，該菌及其纖維素酶在高效糖化纖維素原料中有著潛在的應(yīng)用價值。

[1] Li Q，He Y C，Xian M，et al. Improving enzymatic hydrolysis of wheat straw using ionic liquid 1-ethyl-3-methyl imidazolium diethyl phosphate pretreatment[J].Bioresource Technology，2009，100（14）：3570-3575.

[2] Lynd L R，Laser M S，Brandsby D，et al. How biotech can transform biofuels[J].Nature Biotechnology，2008，26：169-172.

[3] 李強，何玉財，徐鑫，等. 離子液體系中原位酶解高效糖化玉米秸稈[J]. 化工進展，2010，29（5）：958-962。

[4] Biganska O，Navard P. Kinetics of precipitation of cellulose from cellulose-NMMO-water solutions[J].Biomacromolecules，2005，6（4）：1948-1953.

[5] Kuo C H，Lee C K. Enhanced enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse byN-methylmorpholine-N-oxide pretreatment[J].Bioresource Technology，2009，100（2）：866-871.

[6] Petrovan S，Collier J R，Negulescu I I. Pheology of cellulosicN-methylmorpholine oxide monohydrate solutions of different degrees of polymerization[J].Journal of Applied Polymer Science，2001，79（3）：396-405.

[7] Ramakrishnan S，Collier J，Oyetunji R，et al. Enzymatic hydrolysis of cellulose dissolved inN-methyl morpholine oxide/water solutions[J].Bioresource Technology，2010，101（13）：4965-4970.

[8] Wang D，Sun J，Yu H L，et al. MaximumSaccharificationof cellulose complex by an enzyme cocktail supplemented with cellulase from newly isolatedAspergillus fumigatusECU0811[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，166（1）：176-186.

[9] 劉穎，張瑋瑋，王馥. 綠色木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的研究[J].食品工業(yè)科技，2008（3）：128-130.

[10] 許曉鵬，袁士芳，劉立明. 突變黑曲霉高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報，2008，27（5）：124-127.

[11] 李素波，孫智敏，周劍平，等. 康寧木霉菌株的誘變選育及固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國釀造，2008，13：30-33.

[12] 張婷，呂鳳霞，別小妹，等. 黑曲霉Z-25產(chǎn)葡萄糖氧化酶胞外酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J]. 食品科學(xué)，2009，30（3）：209-213.