李存存，張光亞

（華僑大學化工學院，福建 廈門 361021）

傳統(tǒng)酶固定化一般認為是通過酶分子上的氨基酸殘基（如賴氨酸殘基）隨機固定在載體上，這可能會導致酶多個位點和載體結合，破壞了酶天然構象或者出現(xiàn)位阻障礙而妨礙底物進入到酶的活性位點，最終使固定化酶活性大幅度下降[1-3]。Hernandez等[4]認為傳統(tǒng)的固定方法并不是完全隨機的固定而可能是目標蛋白取向很難改變，蛋白質固定化方向難以把握。邵文海等[5]認為酶分子不適合的空間取向使得與底物發(fā)生鄰近定向效應受阻，催化作用減弱。而定向固定能夠按照設定的位置把酶固定在載體上，這更有利于保護酶催化功能，具有更重要的研究與應用價值。采用定向固定化的方法固定化酶，可使酶特定位點直接[6-7]或間接[8-9]與載體結合，酶活性位點位于載體外側，天然構象基本保持不變，有利于底物進入到酶活性位點，顯著提高固定化酶的活力。如Holland等[10]將乙醛/酮還原酶AKR1A1（EC 1.1.1.2）連接一段生物素標簽后，定向固定在帶有鏈霉親和素的載體上，固定化酶活性比隨機固定提高了60～300倍，4℃條件下儲存，7天后酶活保持不變，50天后的酶活仍保持35%，穩(wěn)定性很好。

目前發(fā)展的定向固定化方法主要有：非共價定向固定，主要是抗體與抗原，親和素/鏈霉親和素與生物素以及組氨酸標簽與 Co2+/Ni2+之間的親和作用；共價定向固定，主要是通過半胱氨酸殘基上的巰基與載體直接或間接作用。

本文主要綜述了酶的定向固定方法，并把其與傳統(tǒng)固定化進行了比較，簡述了定向固定化酶在生物傳感器、分子識別、酶生物燃料電池及酶純化方面等領域的應用。

1 非共價定向固定

1.1 抗體與抗原之間的親和作用

若酶作為抗原時，可直接根據抗原抗體之間的親和作用定向固定，羧肽酶A （Carboxy peptidase，CPA）和它的抗體形成復合物的親和常數(shù)可達 109L/mol，這樣羧肽酶 A就可以直接與其抗體緊密結合而固定。另外，若酶分子不能作為抗原，則通過基因融合方法在酶分子的C端或N端融合一段多肽標簽序列，然后酶通過親和作用定向固定在抗多肽標簽的抗體上（圖 1）[4]，用這種方法定向固定來自大腸桿菌的堿性磷酸酯酶[11]（Escherichia coliAlkaine Phosphatase ，EAP），固定化后酶活力為原來的85%。蛋白質A（蛋白A是金黃色葡萄球菌的一種胞壁成分，由單一肽鏈組成）與抗體有很強的結合能力，因而可先在載體上固定化蛋白質A，然后連接目標酶對應的抗體，最終通過親和作用定向固定。這種定向固定的方法適用于酶分子的活性中心背對著其N端或C端氨基酸殘基，同時融合在酶分子上的標簽不能影響其天然結構。

1.2 親和素/鏈霉親和素與生物素之間的親和作用

親和素或鏈霉親和素的亞基可通過專一而又特定的非共價鍵連接到生物素（解離常數(shù)KD為10?15～10?16mol/L）上，這種非共價之間的作用非常強，接近共價鍵[12]。此外這種非共價連接具有抗熱，耐酸堿及不被蛋白酶水解等優(yōu)點。

通常有兩種方法來預處理目標蛋白， 一是生物素?；繕说鞍?，如，E.coli生物素連接酶（BirA）催化依賴ATP的受體肽上的賴氨酸殘基生物素化，在生物傳感器和細胞識別上具有潛在的應用價值[13]。磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶（PPTase）可將生物素化輔酶 A上的 4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉移到?；螂幕d體蛋白。Chirra等[14]首先利用琥珀酰亞胺使得過氧化氫酶生物素酰化，然后把生物素酰化的Au納米顆粒與鏈霉親和素連接，進而過氧化氫酶通過親和作用與納米顆粒連接。葡萄糖氧化酶也可以利用這種方法固定在去鐵鐵蛋白納米顆粒上[15]，固定后的葡萄糖氧化酶酶活力保持約為100%，Km值（酶反應速度為最大值的一半時的底物濃度）與自由酶類似，具有很高的穩(wěn)定性。另一種是把目標蛋白融合到帶有親和素或鏈霉親和素的親和標簽上[16-17]。Dib等[18]于E.coli中表達帶有鏈霉素的D-氨基酸氧化酶重組蛋白，通過親和作用定向固定在D-Strep-Tactin MacroPrep顆粒上。與通過組氨酸標簽固定在鎳螯合基質上的 D-氨基酸氧化酶（Rhodotorula gracilis）[19]相比，此種方法固定的酶，酶活回收率為80%，經過20次緩沖液清洗后，活性保持不變，穩(wěn)定性極大提高。Wang等[20]也通過生物素與鏈霉親和素的親和作用定向固定 D-氨基酸氧化酶于磁性微球上，結果表明，固定化后酶催化效率及穩(wěn)定性都有極大提高。Miladi等[21]將煙草蝕紋病毒蛋白酶定向固定在鏈酶親和素瓊脂糖上，與自由酶相比，固定化的野生型和突變型的煙草蝕紋病毒蛋白酶活性分別保持原有活性的 83%和81%，經過18個月，9個批次反應，酶活回收率分別為38%和51%。這種固定化方法克服了鏈霉親和素在E.coli中溶解度較小的問題[22]，把融合有親和素的目標酶的剪切和純化同步完成。

與其它非共價鍵固定相比，這種定向固定化方法與目標酶的的相互作用更強，因而應用比較廣泛。其缺點是固定過程較其它非共價固定復雜且親和素（69 kDa）和鏈霉親和素（60kDa）分子較大，可能會影響目標酶空間結構[23]。

1.3 多聚組氨酸標簽與Co2+/Ni2+之間的親和作用

利用多聚組氨酸標簽與金屬螯合物或金載體之間的親和作用固定酶已有很多報道。一般用于固定化的過渡金屬離子有Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或 Fe3+，其中主要是Co2+/Ni2+。組氨酸殘基上的咪唑環(huán)可與這些過渡金屬形成穩(wěn)定的螯合鍵[9，24]，為了捕獲二價過渡金屬離子，固定化材料首先通過次氮基三乙酸（氮川三乙酸）或亞氨基二乙酸修飾。這種方法廣泛用于固定化金屬離子親和層析技術（immobilized metal ion-affinity chromatography，IMAC）純化蛋白。酶回收時添加一個競爭性配體（例如咪唑或組氨酸）或通過EDTA絡合作用移除金屬離子，因而固定過程是可逆的。該方法固定化酶在多壁碳納米管和碳納米球原理如圖2所示。

目前通過這種方法定向固定化酶的報道較多，如Nakamura等[25]在Trichoderma viride中表達組氨酸標簽-內切葡萄糖酶Ⅱ重組蛋白，通過親和作用定性固定在氮三乙酸三鈉-Ni2+功能的金納米顆粒上。內切葡萄糖酶Ⅱ活性與自由酶稍有降低，穩(wěn)定性更好。已報道的定向固定化酶如表1所示。一般而言，固定在納米顆粒上的酶回收率高于微米以上的載體，可能是由于納米顆粒比表面積較大[26]。

這種非專一性定向固定化酶的優(yōu)點是從粗酶液中直接固定而不用提前純化目標酶；酶與載體之間結合較緊密，克服了酶泄漏問題；固定酶的天然構象保持不變，活力很高；固定化過程可逆，載體可回收重復利用。

1.4 其它的親和標簽

目前用于親和定向固定化的標簽還有金結合肽，氧化鋅結合肽，氧化鐵親和肽和二氧化硅親和肽等，這些親和標簽與酶親和作用很低，通過重復標簽或者載體表面覆蓋一層聚合物加強酶與載體之間相互作用，一般固定化后用于生物催化。Sarikaya等[39]首先通過基因工程方法合成金結合肽用于結合無機物，研究發(fā)現(xiàn)，3個重復金結合肽有較高親和性結合。Kacar等[40]于E.coli中分別表達不同重復金結合肽堿性磷酸酶重組蛋白，并定向固定在金表面，表明5個重復金結合肽堿性磷酸酶重組蛋白酶活最高。另外，鹵代烷烴脫鹵酶分別與鐵氧化物親和肽或2個重復的二氧化硅親和肽連接。與磁性納米顆粒之間的弱親和作用可以通過納米顆粒表面涂有親水的聚乙二醇或三甲氧基硅烷克服[41]。

利用非共價定向固定的優(yōu)點是：酶與固定載體之間的相互作用專一，穩(wěn)定；固定化過程可逆，固定化材料可重復利用。缺點是在復雜的催化條件下酶容易從載體上脫落。

2 共價定向固定

2.1 通過半胱氨酸殘基固定

表1 已報道的通過多聚組氨酸標簽定向固定酶

最簡單和靈活的酶定向固定化是通過酶分子本身含有的半胱氨酸殘基或特定位點上基團反應[43-44]，從而使酶和載體在特定位點進行固定。Wang等[42]于Kluyveromyces lactis中表達含有半胱氨酸殘基的β-半乳糖苷酶與硫代亞磺酸酯瓊脂糖形成很強的二硫鍵而定向固定。并探索了固定化β-半乳糖苷酶反應器，結果表明在反應器內酶活可保持56%，穩(wěn)態(tài)條件下，乳糖水解達到80%，固定的β-半乳糖苷酶循環(huán)利用4次后，活力保持不變。

如果目標酶多個位點含有半胱氨酸殘基，這種方法就無法實現(xiàn)定向固定，因此Becker等[7]利用自然化學連接（native chemical ligation，NCL）法定向固定了GTP酶，即一個肽的N端半胱氨酸殘基與另一肽C末端的硫酯形成酰胺鍵，這種定向固定不要求目標酶只含有一個半胱氨酸，只需在N端有半胱氨酸殘基或C端有末端硫酯，相應的載體上連有半胱氨酸或者硫酯。Lin等[6]將唾液酸合成酶與內含肽融合，在巰基乙烷磺酸中使目標酶C端硫酯化，進而將其定向固定在半胱氨酸修飾的磁性納米顆粒上。定向固定化酶活保持原來的 76.8%，而隨機固定僅為 33.2%。這種方法的缺點是內含肽分子過大可能會影響目標酶的活性。

2.2 通過點擊化學或Staudinger連接反應固定

點擊化學反應（“Click” Chemistry）[45]是通過Cu(Ⅰ)催化，炔基與疊氮基反應生成區(qū)域選擇性的1,4-三唑，反應機理如圖 3所示。該反應在藥物開發(fā)和生物醫(yī)用材料等的諸多領域中已經成為目前最為有用和吸引人的合成理念之一。炔基與疊氮基分別連接到目標酶和固定載體上，反應后形成共價鍵而定向固定。

蛋白脂肪酸轉移酶可以把含有疊氮基或者炔基的脂肪酸焦磷酸的脂肪酸部分轉移到CaaX肽（其中a是脂肪酸部分，X可以是絲氨酸，甲硫氨酸，谷氨酸，丙氨酸或者蘇氨酸）。例如 Gauchet等[46]通過基因融合的方法在綠色熒光蛋白，增強型綠色熒光蛋白（eGFP）和谷胱甘肽轉移酶的C末端連有CaaX肽，用疊氮基團或炔基進行修飾后就可以定向固定在玻璃表面或者瓊脂糖小球上，固定化的eGFP與其自由的形式具有相同水平的熒光強度，而且CaaX肽對目標酶影響很小。這種定向固定化的缺點是其它含有CaaX肽的酶也會被固定，因而固定之前需對酶進行純化。Brennan等[47]于Thermomyces lanuginosus中表達含有賴氨酸殘基脂肪酶，通過碳化二亞胺耦合反應獲得乙炔基脂肪酶，利用點擊化學反應將其定向固定在金納米顆粒上。結果表明平均每個納米顆粒上有 7個完全的脂肪酶。Gole等[48]和Schlossbauer等[49]分別用類似的方法定向固定胰蛋白酶于金納米顆粒和介孔氧化硅上，結果表明定向固定的胰蛋白酶活力要遠遠高于隨機固定。這種定向固定化具有條件溫和，固定的共價鍵連接緊密而且不可逆等優(yōu)點，但是銅作為催化劑的毒性及不穩(wěn)定性仍然有待進一步解決。

Staudinger連接反應 2000年由 Saxon 和Bertozzi 發(fā)展，一般位于三芳膦上的親電基團（如甲酯）捕獲氮雜葉立德（亞胺基膦烷）中間體，在水介質中進行作用，重排后得到分子內酰胺基氧化膦（圖4），Staudinger 連接反應在化學生物學中有很廣泛的應用，如此反應可用于熒光標記的核苷的合成。Kalia等[50]在牛胰核糖核酸酶的C端連有疊氮基，金表面涂有磷硫酯鍵修飾的自組裝單分子膜，通過Staudinger連接反應定向固定酶在金表面。固定化后酶活力沒有損失，固定化酶可以與其抑制劑形成蛋白質微陣序列。與點擊化學相比，這種方法不需要加入有毒物質Cu，但是反應過程較慢或者無法完全反應。

2.3 酶催化的共價固定

目前，酶催化的目標酶定向固定報道見表 2，微生物谷氨酰胺轉胺酶催化自由胺基與蛋白質或含有谷氨酸殘基肽的氨甲?；纬晒矁r鍵，這種酶可以識別特定的氨基酸序列例如MLAQGS或 LLQG等，Moriyama等[51]報道利用微生物谷氨酰胺轉胺酶催化細菌堿性磷酸酶定向固定在磁性納米顆粒上，固定化酶活力為自由酶的90%以上。類似的還有分煉酶A（Staphylococcus aureus）把蛋白轉移到細胞壁上，此酶從蛋白C端附近保守序列 LPXTG的甘氨酸與蘇氨酸殘基中間切開，蘇氨酸上的羧基和聚甘氨酸或脂肪胺的氨基形成酰胺鍵。與點擊化學反應和Staudinger連接反應相比，酶催化的共價固定具有條件溫和、專一性強等優(yōu)點。但是目標酶需要連有一段多肽標簽序列，這會對酶的構象造成不利影響而使酶活力降低。

3 定向固定化酶的應用

3.1 生物傳感器

具有生物催化能力的酶與傳感器材料如碳同素異形體或金屬納米粒子相結合形成高效的傳感器來分析目標產物。Yang等[38]報道金結合肽（GBP）融合有機磷水解酶重組蛋白固定在涂有石墨烯的金納米顆粒上形成電化學傳感器，這種人工制造的流動注射生物傳感器可以快速檢測農藥含量，具有較短響應時間、低檢測限和高靈敏度等優(yōu)點。

3.2 蛋白質微陣列

酶固定在固體支持物表面形成的蛋白質微陣列可用于少量分析物進行高通量實驗[57]。Soellner等[58]通過 Staudinger連接反應固定核糖核酸酶 S′（縮短的RNase S）在玻璃片表面形成微陣，其酶活力保持約 92%，目前廣泛應用在 RNase 保護檢測，去除非特異結合的RNA，分析RNA 序列，水解蛋白樣品中的RNA，純化DNA等。類似應用的例子還有牛胰核糖核酸酶[50]等。

3.3 分子識別

Dizler等[59]報道來源于E.coil二氫葉酸還原酶（ecDHFR）通過半胱氨酸殘基共價固定在金表面，固定化酶的活力與自由酶相等。并研究了固定ecDHFR的活性位點與其強抑制劑甲氨蝶呤的解離力，結果表明ecDHFR與甲氨蝶呤是通過活性位點特異性相互作用，這為生物大分子的力光譜學（force spectroscopy）應用打開了大門。

表2 已報道的酶催化的共價定向固定化酶

3.4 酶生物染料電池

電極和酶之間的高效接觸在酶生物燃料電池領域至關重要[60]。Holland等[61]報道通過基因改造表達活性中心具有二硫基團的葡萄糖氧化酶，與帶有馬來酰亞胺基的金納米顆粒形成共價鍵而定向固定，定向固定化的酶和電極之間之間高效接觸。在酶生物染料電池和生物傳感器方面有著潛在的應用價值。

3.5 酶的純化

固定化金屬離子親和層析（IMAC）技術就是定向固定在酶純化上應用的例子。Cano等[19]在酵母菌Rhodotorula gracilis中合成了嵌合有組氨酸標簽的 D-氨基酸氧化酶并在E.coli中完全表達，含有組氨酸標簽 D-氨基酸氧化酶粗酶液通過多聚組氨酸標簽與Ni2+之間的親和作用定向固定在柱子上形成螯合物，隨后用含有咪唑的緩沖液把酶洗脫下來，純化的 D-氨基酸氧化酶具有全酶活性，在 25℃下比酶活為115 U/mg，產率為82%。這種定向固定方法降低了生物催化劑的成本，為蛋白質的下游加工過程提供了一個工具。

作者課題組設計了一種新型類彈性蛋白多肽ELPs作為非色譜純化標簽與目標酶融合在一起在E.coli中表達，ELPs相變聚集成顆粒定向固定目標酶進行純化，純化后酶的回收率約為 21.2%，純化倍數(shù)約為 3.2[62]。通過這種方法定向固定化木聚糖酶的最適溫度、最適pH值均與自由酶相同，Km值（6.18 mmol/L）與自由酶接近，穩(wěn)定性有很大的提高，有望開發(fā)成一種新的定向固定化酶方法。

4 展 望

定向固定化酶技術因其較高的活力，良好的穩(wěn)定性和保持酶的天然構象等優(yōu)點而吸引著國內外越來越多研究者的關注。目前，定向固定化酶技術仍處于實驗研究階段，并沒有在工業(yè)生產中大規(guī)模應用。主要存在的問題有：目標酶與載體多位點固定造成酶失活，固定化酶在載體上的位阻，固定化標簽造成酶的活性降低，固定化的條件劇烈，對酶活力影響較大，固定化過程復雜。為了克服這些不足，今后的研究重點是探索新的定向固定化標簽降低對酶活性部位的影響，應用新的載體以提高固定化酶的活性回收率，優(yōu)化固定化過程或簡化固定化步驟等。

[1]Lin P C，Weinrich D，Waldmann H.Protein biochips：Oriented surface immobilization of proteins[J].Macromolecular Chemistry and Physics，2010，211（2）：136-144.

[2]曹黎明，陳歡林.酶的定向固定化方法及其對酶生物活性的影響[J].中國生物工程雜志，2003，23（1）：22-29.

[3]Wilchek M，Miron T.Oriented versus random protein immobilization[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2003，55（1）：67-70.

[4]Hernandez K，F(xiàn)ernandez-Lafuente R.Control of protein immobilization：Coupling immobilization and site-directed mutagenesis to improve biocatalyst or biosensor performance[J].Enzyme and Microbial Technology，2011，48（2）：107-122.

[5]邵文海，張先恩.固定化酶的空間取向控制策略[J].生物技術通報，2000，3（1）：25-28.

[6]Lin P C，Lin C C.Site-specific immobilization of CMP-sialic acid synthetase on magnetic nanoparticles and its use in the synthesis of CMP-sialic acid[J].Chemical Communications，2008（11）：1308-1310.

[7]Becker C F，Marsac Y，Hazarika P，et al.Functional immobilization of the small GTPase Rab6A on DNA-Gold nanoparticles by using a site-specifically attached poly （ethylene glycol）linker and thiol place-exchange reaction[J].ChemBioChem，2007，8（1）：32-36.

[8]Miladi B，El Marjou A，Boeuf G，et al.Oriented immobilization of the tobacco etch virus protease for the cleavage of fusion proteins[J].Journal of Biotechnology，2012，158（3）：97-103.

[9]Balland Vr，Lecomte S，Limoges Bt.Characterization of the electron transfer of a ferrocene redox probe and a histidine-tagged hemoprotein specifically bound to a nitrilotriacetic-terminated self-assembled monolayer[J].Langmuir，2009，25（11）：6532-6542.

[10]Holland Nell K，Beck-Sickinger A G.Specifically immobilised aldo/keto reductase AKR1A1 shows a dramatic increase in activity relative to the randomly immobilised enzyme[J].ChemBioChem，2007，8（9）：1071-1076.

[11]Vishwanath S K，Watson C R，Huang W，et al.Kinetic studies of site-specifically and randomly immobilized alkaline phosphatase on functionalized membranes[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology，1999，68（3）：294-302.

[12]Laitinen O，Hyt?nen V，Nordlund H，et al.Genetically engineered avidins and streptavidins[J].Cellular and Molecular Life Sciences，2006，63（24）：2992-3017.

[13]Chen I，Howarth M，Lin W，et al.Site-specific labeling of cell surface proteins with biophysical probes using biotin ligase[J].Nature Methods，2005，2（2）：99-104.

[14]Chirra H D，Sexton T，Biswal D，et al.Catalase-coupled gold nanoparticles：Comparison between the carbodiimide and biotin–streptavidin methods[J].Acta Biomaterialia，2011，7（7）：2865-2872.

[15]Zhang Y，Tang Z，Wang J，et al.Apoferritin nanoparticle：A novel and biocompatible carrier for enzyme immobilization with enhanced activity and stability[J].Journal of Materials Chemistry，2011，21（43）：17468-17475.

[16]Gaj T，Meyer S C，Ghosh I.The AviD-tag，a NeutrAvidin/avidin specific peptide affinity tag for the immobilization and purification of recombinant proteins[J].Protein Expression and Purification，2007，56（1）：54-61.

[17]Wang J J，Swaisgood H E，Shih J C.Production and characterization of bio-immobilized keratinase in proteolysis and keratinolysis[J].Enzyme Microb.Technol.，2003，32（7）：812-819.

[18]Dib I，Stanzer D，Nidetzky B.Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase：Control of protein quality and opportunities for biocatalysis through production inEscherichia coli[J].Applied and Environmental Microbiology，2007，73（1）：331-333.

[19]Sonia F，Loredano P，Mirella P S.Engineering，expression and purification of a His-tagged chimeric D-amino acid oxidase fromRhodotorula gracilis[J].Enzyme Microb.Technol.，2001，29（6）：407-412.

[20]Wang S J，Yu C Y，Kuan I C.Stabilization of native and double D-amino acid oxidases fromRhodosporidium toruloidesandTrigonopsis variabilisby immobilization on streptavidin-coated magnetic beads[J].Biotechnology Letters，2008，30（11）：1973-1981.

[21]Miladi B，Marjou A E，Boeuf G，et al.Oriented immobilization of the tobacco etch virus protease for the cleavage of fusion proteins[J].Journal of Biotechnology，2012，158（3）：97-103.

[22]Takakura Y，Oka N，Kajiwara H，et al.Tamavidin，a versatile affinity tag for protein purification and immobilization[J].Journal of Biotechnology，2010，145（4）：317-322.

[23]Wong L S，Khan F，Micklefield J.Selective covalent protein immobilization：Strategies and applications[J].Chemicalreviews，2009，109：4025-4053.

[24]Gupta M，Caniard A，Touceda-Varela An，et al.Nitrilotriacetic acid-derivatized quantum dots for simple purification and site-selective fluorescent labeling of active proteins in a single step[J].Bioconjugate Chemistry，2008，19（10）：1964-1967.

[25]Nakamura I，Horikawa Y，Makino A，et al.Enzymatic polymerization catalyzed by immobilized endoglucanase on gold[J].Biomacromolecules，2011，12（3）：785-790.

[26]Liu W，Wang L，Jiang R.Specific enzyme immobilization approaches and their application with nanomaterials[J].Topics in Catalysis，2012，55（16-18）：1146-1156.

[27]Wang L，Xu R，Chen Y，et al.Activity and stability comparison of immobilized NADH oxidase on multi-walled carbon nanotubes，carbon nanospheres，and single-walled carbon nanotubes[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2011，69（3）：120-126.

[28]Wang L，Wei L，Chen Y，et al.Specific and reversible immobilization of NADH oxidase on functionalized carbon nanotubes[J].Journal of Biotechnology，2010，150（1）：57-63.

[29]Zhang H，Lountos G T，Ching C B，et al.Engineering of glycerol dehydrogenase for improved activity towards 1，3-butanediol[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88（1）：117-124.

[30]Liao Y，Cheng Y，Li Q.Preparation of nitrilotriacetic acid/Co2+-linked，silica/boron-coated magnetite nanoparticles for purification of 6×histidine-tagged proteins[J].Journalof Chromatography A，2007，1143（1）：65-71.

[31]Abad J M，Mertens S F，Pita M，et al.Functionalization of thioctic acid-capped gold nanoparticles for specific immobilization of histidine-tagged proteins[J].Journal of the American Chemical Society，2005，127（15）：5689-5694.

[32]Istamboulie G，Andreescu S，Marty J L，et al.Highly sensitive detection of organophosphorus insecticides using magnetic microbeads and genetically engineered acetylcholinesterase[J].Biosensors and Bioelectronics，2007，23（4）：506-512.

[33]Andreescu S，F(xiàn)ournier D，Marty J L.Development of highly sensitive sensor based on bioengineered acetylcholinesterase immobilized by affinity method[J].Analytical Letters，2003，36（9）：1865-1885.

[34]Kuan I，Liao R，Hsieh H，et al.Properties ofRhodotorula gracilisD-amino acid oxidase immobilized on magnetic beads through His-Tag[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2008，105（2）：110-115.

[35]Ho C H，Limberis L，Caldwell K D，et al.A metal-chelating pluronic for immobilization of histidine-tagged proteins at interfaces：Immobilization of firefly luciferase on polystyrene beads[J].Langmuir，1998，14（14）：3889-3894.

[36]Balland V，Hureau C，Cusano A M，et al.Oriented immobilization of a fully active monolayer of histidine-tagged recombinant laccase on modified gold electrodes[J].Chemistry A：European Journal，2008，14（24）：7186-7192.

[37]Herdt A R，Kim B S，Taton T A.Encapsulated magnetic nanoparticles as supports for proteins and recyclable biocatalysts[J].Bioconjugate Chemistry，2007，18（1）：183-189.

[38]Yang M，Choi B G，Park T J，et al.Site-specific immobilization of gold binding polypeptide on gold nanoparticle-coated graphene sheet for biosensor application[J].Nanoscale，2011，3（7）：2950-2956.

[39]Sarikaya M，Tamerler C，Jen AK-Y，et al.Molecular biomimetics： Nanotechnology through biology[J].Nature Materials，2003，2（9）：577-585.

[40]Kacar T，Zin M T，So C，et al.Directed self-immobilization of alkaline phosphatase on micro-patterned substratesviagenetically fused metal-binding peptide[J].Biotechnology and Bioengineering，2009，103（4）：696-705.

[41]Johnson A K，Zawadzka A M，Deobald L A，et al.Novel method for immobilization of enzymes to magnetic nanoparticles[J].Journal of Nanoparticle Research，2008，10（6）：1009-1025.

[42]Wang J，Luck L A，Suni II.Immobilization of the glucose-galactose receptor protein onto a au electrode through a genetically engineered cysteine residue[J].Electrochemical and Solid-state Letters，2007，10（2）：J33-J36.

[43]Camarero J A.Recent developments in the site-specific immobilization of proteins onto solid supports[J].Peptide Science，2007，90（3）：450-458.

[44]Campàs M，Prieto-Simón B，Marty J L.A review of the use of genetically engineered enzymes in electrochemical biosensors[C]//Seminars in Cell & Developmental Biology，Elsevier，2009：3-9.

[45]Rostovtsev V V，Green LG，F(xiàn)okin V V，et al.A stepwise huisgen cycloaddition process： Copper (I)-catalyzed regioselective“l(fā)igation” of azides and terminal alkynes[J].Angewandte Chemie，2002，114（14）：2708-2711.

[46]Gauchet C，Labadie G R，Poulter C D.Regio-and chemoselective covalent immobilization of proteins through unnatural amino acids[J].Journal of the American Chemical Society，2006，128（29）：9274-9275.

[47]Brennan J L，Hatzakis N S，Tshikhudo T R，et al.Bionanoconjugationviaclick chemistry：The creation of functional hybrids of lipases and gold nanoparticles[J].Bioconjugate Chemistry，2006，17（6）：1373-1375.

[48]Gole A，Murphy C J.Azide-derivatized gold nanorods：Functional materials for “click” chemistry[J].Langmuir，2008，24（1）：266-272.

[49]Schlossbauer A，Schaffert D，Kecht J，et al.Click chemistry for high-density biofunctionalization of mesoporous silica[J].Journal of the American Chemical Society，2008，130（38）：12558-12559.

[50]Kalia J，Abbott N L，Raines R T.General method for site-specific protein immobilization by staudinger ligation[J].Bioconjugate Chemistry，2007，18（4）：1064-1069.

[51]Moriyama K，Sung K，Goto M，et al.Immobilization of alkaline phosphatase on magnetic particles by site-specific and covalent cross-linking catalyzed by microbial transglutaminase[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2011，111（6）：650-653.

[52]Ito T，Sadamoto R，Naruchi K，et al.Highly oriented recombinant glycosyltransferases：Site-specific immobilization of unstable membrane proteins by usingStaphylococcus aureus sortaseA[J].Biochemistry，2010，49（11）：2604-2614.

[53]Sugimura Y，Ueda H，Maki M，et al.Novel site-specific immobilization of a functional protein using a preferred substrate sequence for transglutaminase 2[J].Journal of Biotechnology，2007，131（2）：121-127.

[54]Wong L S，Thirlway J，Micklefield J.Direct site-selective covalent protein immobilization catalyzed by a phosphopantetheinyl transferase[J].Journal of the American Chemical Society，2008，130（37）：12456-12464.

[55]Wong L S，Okrasa K，Micklefield J.Site-selective immobilisation of functional enzymes on to polystyrene nanoparticles[J].Organic &Biomolecular Chemistry，2010，8（4）：782-787.

[56]Yin J，Straight P D，McLoughlin S M，et al.Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（44）：15815-15820.

[57]Lee Y S，Mrksich M.Protein chips：From concept to practice[J].Trends in Biotechnology，2002，20（12）：s14-s18.

[58]Soellner M B，Dickson K A，Nilsson B L，et al.Site-specific protein immobilization by Staudinger ligation[J].Journal of the American Chemical Society，2003，125（39）：11790-11791.

[59]Ditzler L R，Sen A，Gannon M J，et al.Self-assembled enzymatic monolayer directly bound to a gold surface：Activity and molecular recognition force spectroscopy studies[J].Journal of the American Chemical Society，2011，133（34）：13284-13287.

[60]Barton S C，Gallaway J，Atanassov P.Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices[J].Chemical Reviews，2004，104：4867-4886.

[61]Holland J T，Lau C，Brozik S，et al.Engineering of glucose oxidase for direct electron transferviasite-specific gold nanoparticle conjugation[J].Journal of the American Chemical Society，2011，133（48）：19262-19265.

[62]付曉平，王文研，張光亞.以類彈性蛋白多肽為標簽的表達質粒構建及其用于木聚糖酶的非色譜純化[J].微生物學報，2012，52（1）：90-95.