丁雪冰 王雪晶 馬明明 朱 清 邵鳳民△

1）河南省人民醫(yī)院腎病風濕科 鄭州 450003 2）鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 3）河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

伴有皮質(zhì)下梗死和白質(zhì)腦病的常染色體顯性遺傳性腦動脈?。╟erebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）是最常見的遺傳性卒中疾病。本病病理改變是一種非動脈硬化性、非淀粉樣變性，小動脈病，嗜鋨顆粒（granular osmiophilicmateria，GOM）的沉積于血管平滑肌基底膜是它特征性病理改變［1］。其發(fā)病與Notch3基因突變導致小血管平滑肌細胞退行性改變相關(guān)［2］。

1993年Tournier－Lasserve等首次從兩個法國CADASIL家系中，應用遺傳連鎖分析方法將CADASIL基因定位于19p12內(nèi)D19S221至D19S222區(qū)間的14cM的區(qū)的Notch3基因［3］。Notch3基因在CADASIL的發(fā)病過程中的重要性已經(jīng)得到公認，但是其表達的蛋白在發(fā)病中機制如何至今尚不能確定。2002年Utku教授首次在土耳其的一例CADASIL家系中發(fā)現(xiàn)了Notch3基因R90C突變［4］。R90C突變存在于Notch3基因的第三個外顯子區(qū)域，編碼細胞外區(qū)表皮樣生長因子重復序列（EGF－like）的胞外段，免疫組織化學研究顯示，攜帶此突變的患者，其小動脈血管平滑肌細胞Notch3胞外段清除障礙，在細胞膜大量堆積本病病理改變是一種非動脈硬化性、非淀粉樣變性，小動脈病，嗜鋨顆粒（granular osmiophilicmateria，GOM）的沉積于血管平滑肌基底膜是它特征性病理改變［5］。但Notch3（R90C）突變蛋白的具體致病機制，至今仍未明確。

1 材料與方法

1.1材料Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C）質(zhì)粒由北 京 賽 諾 基 因 有 限 公 司 （www.sinogenomax.com／en／default.aspx）構(gòu)建合成。大鼠主動脈血管平滑肌細胞A10由加拿大多倫多大學Jane McGlade博士惠贈。DMEM培養(yǎng)基、OPTI－MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購于美國GIBCO公司，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000購于美國Invitrogen公司，抗Beclin 1抗體購于美國Abcam公司、LC 3抗體購于Eptimics公司、GAPDH抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購于美國Promega公司。MDC購于Sigma公司。

1.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染A10細胞常規(guī)培養(yǎng)于10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中。待細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底30%～40%后，棄去DMEM，每孔加入1mL OPTI－MEM，將3%5μL的質(zhì)粒及2.0μL lipofectamine TM 2000分別與100μL OPTIMEM混勻后，共同加入六孔板的每個孔中，混勻，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6h，改用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48h。

1.3 Western blot檢測細胞Beclin 1蛋白及LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值SH－SY5Y 細胞分別轉(zhuǎn)染 Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C）48h后，提取細胞總蛋白，做 SDS－PAGE電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h，TBST洗3次，加入抗Beclin 1（1∶800）、抗LC3（1∶300）抗體，4℃過夜。加人過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶5000），置于水平脫色搖床上孵育2h，TBST漂洗3次，ECL光化學法顯色。凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描。

1.4 MDC檢測細胞自噬空泡變化MDC是一種自噬空泡的標志物，可以通過MDC染色觀察判斷細胞自噬過程的發(fā)生。SH－SY5Y細胞分別轉(zhuǎn)染 Flag－N1、Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch 3（R90C）24h后，以4%多聚甲醛，4℃下固定10 min，PBS洗3遍，加入終濃度為50μmol／L的MDC染色液，37℃下孵育60min，PBS洗3遍，熒光顯微鏡下觀察細胞自噬空泡的變化。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡A10細胞分別轉(zhuǎn)染Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C）24h后，取100μL細胞懸液加入5μL Annexin－／FITC和20μg／mL PI溶液10μL，混勻后室溫避光孵育15min，加入400μL PBS，以流式細胞儀PI／Annexin－V－FITC檢測細胞凋亡情況。

1.6統(tǒng)計學分析Alpha Ease FC（FluorChem8900）軟件分析圖像，實驗數(shù)據(jù)采用均值±標準差（s）表示，所得實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件行方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測細胞內(nèi)源性Beclin 1蛋白、LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的表達在 A10細胞內(nèi)過表達Flag、Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C），Western blot結(jié)果顯示，與Flag相比，過表達Flag－Notch3（WT），使 A10細胞中Beclin 1表達上調(diào)且LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值增高；與Flag－Notch3（WT）相比，過表達Flag－Notch3（R90C）使 A10細胞中Beclin1表達明顯下調(diào)且LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值降低。如圖1所示。

圖1 Western blot檢測A10細胞內(nèi)源性Becline 1蛋白及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表達

2.2 MDC染色檢測SH－SY5Y細胞中自噬空泡的變化在A10細胞內(nèi)過表達Flag－Notch3（WT）、Flag－Notch3（R90C），MDC染色結(jié)果顯示，與 Flag－Notch3（WT）相比，過表達Flag－Notch3（R90C）導致 MDC染色信號減弱，自噬空泡聚集減少。結(jié)果如圖2所示。

圖2 MDC染色檢測SH－SY5Y細胞中自噬空泡的變化（免疫熒光 ×400）

2.3 PI／Annexin－V－FITC檢測Notch3（R90C）對細胞凋亡率的影響PI／Annexin－V－FITC檢測細胞凋亡率，結(jié)果顯示，與Flag－Notch3（WT）相比，過表達Flag－Notch3（R90C）增加細胞凋亡率。如圖3所示。

圖3 PI／Annexin V－FITC檢測細胞凋亡率的變化

3 討論

Notch3基因是CADASIL的致病基因，編碼含有2321個氨基酸的跨膜受體蛋白。Notch3基因在正常組織中主要表達于血管平滑肌細胞。Notch3基因致病性突變導致EGF序列半胱氨酸殘基產(chǎn)生，破壞了原有的二硫鍵配對，導致血管平滑肌細胞功能異常而致?。?］。Joutel等人研究發(fā)現(xiàn)在CADASIL病人的組織中，Notch3蛋白胞膜外區(qū)域無法正常降解，在血管平滑肌表面積聚；并推測這可能是Notch3蛋白突變體的致病機制［7］。

自噬是細胞內(nèi)的大分子營養(yǎng)物質(zhì)和細胞器在溶酶體內(nèi)降解的過程［8］。自噬過程可分為微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬。在巨自噬形成過程中，LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值明顯增高。Beclin 1通過與Vps34結(jié)合激活P13K通過促進自噬體的形成，能夠反映體內(nèi)巨自噬的激活水平［9］。細胞內(nèi)環(huán)境紊亂時，細胞自噬被抑制，導致蛋白降解障礙，在細胞內(nèi)聚集而致?。?0］。

本研究發(fā)現(xiàn)Notch3（R90C）通過下調(diào)A10細胞中Beclin 1蛋白及LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值，抑制自噬水平，促進細胞凋亡。由此我們認為，Notch3（R90C）通過抑制血管平滑肌細胞自噬誘導神經(jīng)元細胞凋亡；調(diào)控自噬可能成為CADASIL治療一個新的方向。

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