潘 亮，孔令軍，孫建娜，梁朝輝

(1.河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院，河北 滄州061001;2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院，河北滄州061000)

膠質瘤是顱內常見的惡性腫瘤之一，病因不明確。目前以手術、放療和化療為主的治療手段已不能治愈腫瘤，腫瘤經過一段時間后多會復發(fā)。CD133是一種分子量為120 ku的細胞表面蛋白，是目前比較公認的腦腫瘤干細胞和神經干細胞的表面標志物。本研究應用免疫組化方法檢測不同級別的人腦膠質瘤組織中CD133的表達及腫瘤微血管密度(MVD)，旨在進一步明確CD133蛋白水平與膠質瘤新生血管形成的關系，為應用抗血管生成療法治療腦膠質瘤提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 病例資料:研究對象為手術切除并經病理證實的46例腦膠質瘤患者，男性28例，女性18例，年齡14～65歲，平均42歲。根據2000年修改的WHO神經系統(tǒng)腫瘤分級標準對其進行組織學的分類分級，其中Ⅰ級7例，Ⅱ級18例，Ⅲ級13例，Ⅳ級8例。另取5例因顱腦損傷行內減壓術的正常腦組織作對照，所有膠質瘤患者術前均未接受過化療或放療等輔助治療。所有標本經10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚切片編碼備用。

1.2 主要試劑:兔抗人CD133單克隆抗體(濃縮型)購自博士德公司，SP免疫組化染色試劑盒購自河北博海生物公司，CD34單克隆抗體、DAB試劑盒、PBS緩沖液和檸檬酸鹽抗原修復液，均購自北京中杉生物技術有限公司。

1.3 免疫組織化學染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水漂洗3min，切片置0.01mol/L，枸櫞酸緩沖液(PH6.0)中用煮沸(95℃，15～20min)進行抗原修復，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫。取出切片，蒸餾水沖洗2次，3min/次，用 0.01mol/L PBS液沖洗2次共5 min。使用3%雙氧水阻斷滅活內源性過氧化物酶，CD133一抗稀釋度1:200，按照試劑盒說明進行操作(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)，甩去PBS液，每張片滴加2滴新配制的DAB溶液(按說明書配制)，3～5min后顯微鏡下觀察顯色情況。蒸餾水充分沖洗，蘇木精輕度復染1min，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。CD34染色步驟:石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(PH值7.4)沖洗3次，3min/次，切片加入裝有150mL，0.01%枸櫞酸150mL微波抗原修復8min，涼至室溫30min，3%過氧化氫室溫孵育5min，一抗室溫孵育90min，生物素化二抗室溫孵育10min，DAB孵育5min，復染、透明、封片。

1.4 結果判定:CD133為跨膜蛋白，定位于細胞膜及細胞漿，以細胞膜和細胞漿出現棕黃色為陽性，低倍和高倍鏡下觀察并在高倍鏡(400X)下隨機選擇5個視野，計算出陽性細胞所占的百分率。結果判定標準:陰性(－)，腫瘤組織完全不著色或陽性細胞數小于5%;弱陽性(+)，腫瘤組織陽性細胞數6% ～25%;陽性(++)，腫瘤組織陽性細胞數25%～50%;強陽性(+++)，腫瘤組織陽性數大于50%。平均微血管密度(microvesselsdensity，MVD)的判定和MVD值計數CD34染色陽性為血管內皮細胞膜或細胞質呈棕黃色或棕褐色。新生血管通常以腫瘤內MVD來表示，具體參照Weidner報道的方法。每張切片記錄5個高倍視野下微血管數目，取其平均值作為該標本的MVD(個/視野)，用MVD值表達CD34表達數量。

1.5 統(tǒng)計學方法:全部實驗數據均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析處理。根據比較對象的不同，分別使用χ2檢驗和Sperman相關性分析等方法。

2 結果

2.1 CD133在膠質瘤組織中的表達情況:本研究46例腦膠質瘤組織中CD133總陽性表達率為80.4%，其中強表達6例(13.1%)，中度表達 18 例(39.1%)，弱表達 13 例(28.2%)，不表達9例(19.6%)。CD133表達在不同分化程度組織差異有統(tǒng)計學意義(χ2=29.885，P ＜0.01)，CD133 表達水平與腦膠質瘤病理級別成正向中等程度相關(r=0.597，P＜0.01)，見表1。隨著膠質瘤級別的升高，CD133陽性細胞表達明顯增高，見圖1。正常腦組織CD133陰性表達。

表1 CD133的表達與膠質瘤分級的關系 例

圖1 CD133在膠質瘤中的表達(SP400X)AWHOⅠ級;BWHOⅡ級;CWHOⅢ級;DWHOⅣ級

2.2 腫瘤微血管密度(MVD)檢測:不同級別的膠質瘤組織中MVD值，見表2，各組間總體存在差異有統(tǒng)計學意義(χ2=33.204，P ＜0.01)，進一步進行兩兩比較，除Ⅲ級與Ⅳ級之間的差異沒有統(tǒng)計學意義外(χ2=3.824，P ＞0.05)，其余各級之間均存在差異，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。各級別膠質瘤組織中MVD染色，見圖2。

表2 膠質瘤組織MVD與病理級別的關系

2.3 CD133表達強度與腫瘤MVD的關系:對表達不同強度CD133的膠質瘤組織中的MVD情況進行分析發(fā)現隨著CD133蛋白表達強度的增加，MVD值呈上升趨勢，見表3。

圖2 CD34在膠質瘤中的表達(SP400X)AWHOⅠ級;BWHOⅡ級;CWHOⅢ級;DWHOⅣ級

表3 膠質瘤組織中CD133表達與MVD的關系

3 討論

本實驗發(fā)現人腦膠質瘤中CD34－MVD值與CD133陽性細胞的表達成正相關性。在低級別腦膠質細胞腫瘤中CD133陽性細胞表達很低，以零星分布。而在高級別腦膠質瘤組織切片上可見數個細胞聚集在一起，并多數是圍繞著血管或在血管旁，而且見到的巢狀分布的均近血管邊緣。

微血管作為腫瘤干細胞生存微環(huán)境的重要組成，不僅供應了TSC生長所需的營養(yǎng)，還提高了TSC的自我更新和增殖能力。內皮細胞不僅能通過分泌細胞因子維持TSC的特性[1］，而且一些研究顯示內皮在TSC的抗化療、放療中起著非常重要的作用。同時，TSC也促進微血管的形成。Bao[2］通過體內成瘤實驗發(fā)現TSC與普通腦腫瘤細胞種植形成的腫瘤在外觀及病理特征上存在顯著差異，前者形成的腫瘤血供更豐富，壞死和出血更多。因此，腫瘤干細胞的自我更新和增殖必須有微血管的支持，而腫瘤干細胞的增殖又可刺激微血管的生成。所以，腫瘤干細胞與腫瘤微血管是相互促進相互依賴的。

TSC與微血管之間相互支持和促進，抗血管生成治療不僅切斷了腦腫瘤生長所需的營養(yǎng)供應通道，還可降低TSC的自我更新和增殖能力，而針對TSC治療的同時亦能減少腫瘤的血供，所以進一步探討腫瘤干細胞和微血管之間的信號傳導，將為進一步了解TSC的生物學特性提供了新的方向和靶向治療TSC、微血管打開新的局面。

[1]McKayR． Stem cells in the central nervous system［J］． Science，1997，276: 66 － 71．

[2]Bao S，Wu Q，Sathornsumetee S， et al． Stem cell － like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor［J］． Cancer Res， 2006， 66( 16) : 7843 － 7848．