楊 文，李海霞，陳麗珍，翟銳銳

（1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南?？?71199；2.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?571199）

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種重要的黃酮類(lèi)化合物，是一種具有廣泛生物活性的重要中藥有效成分，并且是一種重要的功效添加成分，其結(jié)構(gòu)具有超高的離域度、完整的大π鍵共軛體系及強(qiáng)配位氧原子與合適的空間構(gòu)型，與金屬離子具有較強(qiáng)的螯合作用。研究報(bào)道[1-2]，黃酮類(lèi)金屬配合物的生物活性通常與金屬中心離子的性質(zhì)有關(guān)，且黃酮類(lèi)與金屬離子螯合生成配合物后生物活性增強(qiáng)，甚至有新的藥理活性產(chǎn)生。二氫楊梅素（DMY）是具有抗菌、抗病毒、護(hù)肝、抗氧化、影響肝內(nèi)重要的藥物（毒物、致癌物）代謝酶細(xì)胞色素P450等作用的黃酮類(lèi)化合物[3-4]。鎳是所有生命體必需的微量元素，主要作用是激活人體中的各種酶，具有獨(dú)特的協(xié)調(diào)和催化電子轉(zhuǎn)移特性，對(duì)維持人體生理功能起重要作用[5-6]。本文利用天然產(chǎn)物藤茶有機(jī)活性成分二氫楊梅素，考察二氫楊梅素配合鎳的合成、表征及其對(duì)臨床常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和白假絲酵母菌的抗菌活性，為其他天然產(chǎn)物的藥物及食品添加劑研制開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤茶 產(chǎn)地廣西；二氫楊梅素 為實(shí)驗(yàn)室自制[7]；乙酸鎳 西隴化工股份有限公司，分析純；無(wú)水乙醇廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純；水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）瓊脂培養(yǎng)基、MH液體培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基 杭州天和微生物試劑有限公司。

JASCO-FI-IR-4100型傅立葉變換紅外光譜儀華洋科儀公司；AE 100型電子分析天平 蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司；SHB-B95A型循環(huán)水式真空泵 西安太康生物科技有限公司；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器美國(guó)致微（廈門(mén)）儀器公司；生化培養(yǎng)箱 上海博迅儀器有限公司；DZF-6021型真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；三口燒瓶。

1.2 配合物的合成

將0.3202g（1mmol）二氫楊梅素加入50mL無(wú)水乙醇，在100mL的圓底燒瓶中于50℃加熱攪拌溶解。加入無(wú)水醋酸鈉，反應(yīng)一定時(shí)間，調(diào)反應(yīng)液的pH為7.5；按摩爾比1∶1加入乙酸鎳（1mmol），攪拌回流6h。冷卻至室溫，抽濾，用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌沉淀，然后于50℃真空干燥10h，得土黃色固體。

1.3 抑菌方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備 按試劑使用說(shuō)明進(jìn)行配制并高壓滅菌處理，4℃冷藏備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)藥物的配制 二氫楊梅素金屬鎳配合物DMY-Ni的配制：稱(chēng)取0.0400g，加入1.8%鹽酸3滴助溶，加無(wú)菌注射用水定容至50mL，藥物的最終濃度800μg/mL。二氫楊梅素DMY的配制：稱(chēng)取0.0400g，熱溶于50mL蒸餾水中，藥物的最終濃度800μg/mL。分別稱(chēng)取以上兩種合成藥物DMY-Ni和DMY，并配成藥物終濃度為800μg/mL，經(jīng)115℃10min高溫滅菌處理備用。

1.3.3 活化菌種 斜面活化菌種，37℃培養(yǎng)18～20h后接種至MH瓊脂平板，酵母菌28℃48h接種至沙氏瓊脂平板。

1.3.4 菌懸液的制備 取傳出新鮮菌株編號(hào)排序，并分別制成相當(dāng)0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)比濁管濃度菌液，再用液體培養(yǎng)基稀釋成105CFU/mL實(shí)驗(yàn)菌液備用。

1.3.5 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定采用 試管二倍稀釋法進(jìn)行，分別取上述藥物DMY-Ni和DMY，在無(wú)菌條件下用MH肉湯分別以二倍稀釋法將藥物稀釋?zhuān)垢魉幬锖胁煌瑵舛鹊膽?yīng)用液，分別為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125μg/mL共10個(gè)濃度，每管1mL。同樣方法用沙氏液體培養(yǎng)基將藥物稀釋成10個(gè)濃度。同時(shí)設(shè)藥物空白、陰性、陽(yáng)性對(duì)照管。在上述10個(gè)不同濃度及陽(yáng)性對(duì)照管中，每管加入實(shí)驗(yàn)菌液0.1mL，充分混勻，置37℃培養(yǎng)18～20h，觀察并記錄結(jié)果。酵母菌置28℃培養(yǎng)48h，觀察并記錄結(jié)果。以藥物空白管、陰性對(duì)照管無(wú)菌生長(zhǎng)，無(wú)藥陽(yáng)性對(duì)照管菌株生長(zhǎng)良好，標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC）為對(duì)照。以肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)的試管中所含藥物的最低濃度即為最低抑菌濃度，重復(fù)3次。

1.3.6 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定 將未見(jiàn)細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)管，每管取出0.1mL培養(yǎng)液接種于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)18～20h，觀察并記錄結(jié)果。酵母菌置28℃培養(yǎng)48h，觀察并記錄結(jié)果。在藥物空白管、陰性對(duì)照管無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照管菌株生長(zhǎng)正常的條件下，凡接種的平板上菌落少于5個(gè)或未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MBC，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 二氫楊梅素-鎳金屬配合物的表征

2.1.1 配合物的紅外光譜 采用KBr壓片法，對(duì)DMY-Ni配合物進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，3426.89cm-1是苯環(huán)上的羥基O-H伸縮振動(dòng)吸收，說(shuō)明配合物存在羥基；2368.12cm-1歸屬于苯環(huán)上的C-H伸縮振動(dòng)吸收；二氫楊梅素在1641.45cm-1處有強(qiáng)吸收峰，這是由于4位羰基與5位羥基偶合作用，形成二氫楊梅素-鎳（Ⅱ）配合物后，由于金屬離子成鍵作用，使得4位羰基碳氧雙鍵更弱，吸收峰位置移至1592.91cm-1處，向低波數(shù)移動(dòng)了48.54cm-1；配合物和二氫楊梅素的ν（C-O-C）相比，變化較小，也表明了C環(huán)上的氧并未與金屬離子發(fā)生作用；配合物在608.43cm-1處出現(xiàn)了ν（O-M），說(shuō)明鎳離子與二氫楊梅素發(fā)生了作用并形成以Ni-O鍵結(jié)合的二氫楊梅素-鎳配合物。

2.1.2 紫外光譜 以二甲基亞砜為溶劑，測(cè)量了二氫楊梅素及其鎳配合物的紫外光譜，見(jiàn)圖2～圖3。由圖2知，二氫楊梅素在292.5nm處有最大吸收峰，與Ni（Ⅱ）配位后，其在308nm處出現(xiàn)最大吸收，最大吸收峰紅移了15nm，證明鎳與二氫楊梅素形成了配合物，使其二氫楊梅素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

表1 二氫楊梅素-鎳配合物的抑菌情況（n=3）Table 1Antibacterial activity of DMY-Ni（n=3）

2.1.3 熱重分析 二氫楊梅素鎳配合物的熱重分析見(jiàn)圖4。配合物的第一失重階段在50～150℃之間，失重率為22.45%，此階段失重的水為配合物分子外的結(jié)晶水，與失去7個(gè)水分子的量相當(dāng)。第二個(gè)階段從220～550℃，配體迅速燃燒分解，為骨架斷裂峰，失重率為65.57%，與失去1個(gè)配體分子及兩個(gè)氯原子相當(dāng)。最終分解產(chǎn)物是鎳的氧化物。推測(cè)配合物的組成為[Ni（C15H11O8）Cl2]·7H2O。

2.2 二氫楊梅素-鎳配合物的抑菌活性

試管液體隨藥物濃度降低，菌株生長(zhǎng)梯度抑制程度下降，證明實(shí)驗(yàn)成功，結(jié)果可靠。二氫楊梅素及二氫楊梅素-鎳配合物的抑菌及殺菌結(jié)果見(jiàn)表1～表3。

由表1～表3可知，二氫楊梅素-鎳配合物對(duì)所測(cè)白假絲酵母菌均顯示出較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，白假絲酵母菌MIC為6.25～12.5μg/mL，MBC為6.25～25μg/mL，但對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌無(wú)明顯的抑制和殺菌作用。而二氫楊梅素對(duì)所測(cè)的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有一定的抑菌和殺菌作用，其中金黃色葡萄球菌MIC為50～100μg/mL，MBC為50～100μg/mL；大腸埃希菌MIC為200～400μg/mL，MBC為200～400μg/mL，但對(duì)白假絲酵母菌無(wú)明顯的抑制和殺菌作用。

表2 二氫楊梅素-鎳配合物與二氫楊梅素的MBC值（n=3）Table 2The germicidal dosage of DMY and DMY-Ni（n=3）

表3 二氫楊梅素的抑菌情況（n=3）Table 3 Antibacterial activity of Dihydromyricetin（n=3）

部分金屬的配合物與其配體相比，抗菌活性明顯提高的原因，可能是配合物本身的脂溶性增加，有強(qiáng)烈的滲透到微生物膜內(nèi)部的特性[8-9]。二氫楊梅素-鎳配合物對(duì)白假絲酵母菌顯示出較強(qiáng)的抑菌和殺菌作用，這表明形成配合物后，更容易滲透到白假絲酵母菌膜內(nèi)部，金屬離子與配體二氫楊梅素可能產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)了抑菌和殺菌效果[10]。但是配合物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌和殺菌作用不明顯，此結(jié)果的闡明，應(yīng)從殺菌機(jī)理入手，有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

二氫楊梅素與鎳離子發(fā)生配位形成二氫楊梅素-鎳（Ⅱ）配合物，根據(jù)紅外光譜、紫外光譜及熱重分析的結(jié)果，可以推斷配合物的組成為[Ni（C15H11O8）Cl2]·7H2O。二氫楊梅素-鎳配合物對(duì)白假絲酵母菌的抑菌作用明顯，這可為臨床疾病的治療提供一個(gè)可參考的途徑，但二氫楊梅素-鎳配合物對(duì)機(jī)體是否存在毒性，有待進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。二氫楊梅素對(duì)細(xì)菌（金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌）有不同程度的抑菌和殺菌作用，但對(duì)酵母菌無(wú)明顯的抑制和殺菌作用，這與之前報(bào)道的相一致[11-12]。二氫楊梅素資源豐富，與金屬鎳配合可以發(fā)揮不同的抗菌活性，為黃酮類(lèi)藥物的研究提供一種新的思路和途徑。

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