王淑英，鄔 劍，李 堯，王景霞，張 輝，李 文，齊亞靈，李慧玲

（1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2.佳木斯婦幼保健院，黑龍江 佳木斯154003；3.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154003）

近些年來人們發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞參與免疫反應(yīng)[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血后變得異常活躍，缺血性腦損傷以后小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)極復(fù)雜，已超出了清除變性壞死組織和對(duì)神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)作用的范圍[2]。本實(shí)采用大鼠局灶性腦缺血－再灌注模型，探討銀杏葉提取物（Extract of Ginkgo biloba，EGB）對(duì)缺血－再灌注中小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

成年Wistar大鼠72只，體重280～380g，隨機(jī)分為假手術(shù)組：只做分離動(dòng)脈手術(shù)，大腦中動(dòng)脈不栓塞；缺血－再灌注組，栓塞大腦中動(dòng)脈2h，再灌注24h；EGB治療組：栓塞大腦中動(dòng)脈2h，栓塞2min內(nèi)進(jìn)行尾靜脈注射EGB（20mg／kg），再灌注24h內(nèi)，給藥共3次。每組24只。手術(shù)前12h禁食，可自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 栓子的制備

將一根直徑0.23mm、長(zhǎng)35mm的尼龍釣魚線的一端均勻地涂上一層聚胺酯，使其直徑達(dá)到0.25～0.26mm，晾干待用。

1.2.2 大鼠局灶性腦缺血－再灌注模型的制備

采取頸內(nèi)動(dòng)脈插入線法造模[3～5]。Wistar大鼠用3.5%水合氯醛（350mg／kg）麻醉，仰臥固定。切開頸部正中皮膚，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），仔細(xì)分離避免刺激迷走神經(jīng)。由CCA分叉處向頭端依次游離，用電熱燒灼器燒斷頸外動(dòng)脈所有分枝，使其主干游離。然后分離ICA至顱底，并分離出ICA顱外段的唯一分支翼腭動(dòng)脈（PPA）。用蛙心夾夾住CCA和ICA，并在ECA（靠近CCA分叉處）上剪一小口，將制好的栓子（預(yù)先蘸有肝素鈉溶液）沿切口插入ECA，經(jīng)CCA分叉處并將預(yù)先放置于ECA根部的手術(shù)縫合線縛緊，防止栓子滑出和出血，然后放開ICA上的蛙心夾，將栓子緩慢地向ICA入顱方向推進(jìn)約19～21mm，微遇阻力即停，使栓子頭端停留在大腦中動(dòng)脈（MCA）與大腦前動(dòng)脈（ACA）分叉處。固定好栓子，即完成一側(cè)MCA的栓塞。栓塞2h后，緩慢的輕拉栓子使其頭端回到ECA內(nèi)，即可實(shí)現(xiàn)MCA再灌注。

1.2.3 EGB干預(yù)

術(shù)后2min尾靜脈給藥，20mg／kg，每天3次。

1.2.4 神經(jīng)病學(xué)評(píng)分

參考Kuluz[6]神經(jīng)缺陷三級(jí)評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物清醒后分別在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分。符合條件的大鼠才可進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

1.3 小膠質(zhì)細(xì)胞的檢測(cè)

1.3.1 硝酸銀染色法

染色步驟：（1）組織固定于FAB液（溴化銨－福爾馬林）；（2）冰凍切片20μm；（3）在含有數(shù)滴氨水的蒸餾水中洗30s；（4）蒸餾水洗2次；（5）浸碳酸銀液體30s；（6）10%福爾馬林還原；（7）蒸餾水洗；（8）0.2%氯化金調(diào)色10min；（9）蒸餾水洗；（10）5%次亞硫酸鈉固定5min；（11）蒸餾水洗；（12）脫水、透明、封固。

1.3.2 S－100蛋白表達(dá)檢測(cè)－SABC

步驟如下：（1）冰凍切片，載玻片防脫片處理：經(jīng)Polylysine防脫片處理。（2）低溫恒冷切片機(jī)大鼠腦連續(xù)切片厚20μm。撈于Poly－lysine防脫片處理載玻片。（3）純丙酮室溫固定30min。蒸餾水洗。（干燥后冰凍保存）。（4）純甲醇加H2O2至0.3%，室溫浸泡30min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次。0.1MPBS洗2min×3次。（5）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。甩去多余液體，不洗。（6）滴加適當(dāng)稀釋的一抗S－100（一抗的稀釋度1：1000.1M PBS稀釋），4℃過夜。0.1MPBS洗，2min×3次。（7）滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20min。0.1MPBS洗2min×3次。（8）滴加 HIGH－SABC，37℃20min。0.1MPBS洗5min×4次。（9）DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒。取1mL蒸餾水，加試劑盒中A，B，C試劑各一滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌。（10）蘇木素輕度復(fù)染。脫水、透明、封片。顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS軟件處理，組間采用方差分析，組內(nèi)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性差異水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞AgNO3染色觀察

假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，突起比較長(zhǎng)（圖1）；缺血2h再－灌注24h組，在神經(jīng)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害的梗死區(qū)邊緣，小膠質(zhì)細(xì)胞肥大、增生，而在含散在萎縮神經(jīng)元的梗死毗鄰區(qū)域出現(xiàn)圓狀、阿米巴狀、桿狀小膠質(zhì)細(xì)胞（圖2）；EGB治療組與缺血2h再灌注24h組比較細(xì)胞數(shù)量多，突起較長(zhǎng)（圖3）。

圖1 假手術(shù)組AgNO3染色400×

2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞S－100免疫組化染色觀察

缺血2h再灌注24h組小膠質(zhì)細(xì)胞S－100陽性細(xì)胞數(shù)量與假手術(shù)組（圖4）相比明顯增多，小膠質(zhì)細(xì)胞增生（圖5）；EGB治療組S－100陽性細(xì)胞數(shù)介于假手術(shù)組與缺血2h再灌注24h組之間（圖6）。

圖2 缺血－再灌注組AgNO3染色400×

圖3 EGB治療組AgNO3染色400×

圖4 假手術(shù)組S－100陽性細(xì)胞100×

圖5 缺血－再灌注組S－100陽性細(xì)胞100×

圖6 EGB治療組S－100陽性細(xì)胞100×

3 討論

幾十年來人們對(duì)EGBCNS的作用進(jìn)行了大量的研究，表明EGB對(duì)CNS的保護(hù)作用明顯，能促進(jìn)神經(jīng)元的可塑性，保護(hù)神經(jīng)元的缺血損傷。但腦缺血－再灌注后EGB對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響少見報(bào)道。小膠質(zhì)細(xì)胞在CNS損傷時(shí)能轉(zhuǎn)變?yōu)橛型淌赡芰Φ男∧z質(zhì)細(xì)胞，清除壞死的細(xì)胞及結(jié)構(gòu)損傷的髓鞘，在免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。腦缺血－再灌注后缺血損害區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，其形態(tài)表現(xiàn)為圓形、阿米巴狀、桿狀，并分化、增殖，S－100蛋白表達(dá)增強(qiáng)，形態(tài)的變化表明其已轉(zhuǎn)化為具有吞噬能力的小膠質(zhì)細(xì)胞，參與病理生理過程，本實(shí)驗(yàn)中缺血2h再灌注24h組結(jié)果與其一致。小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬清除病原體和細(xì)胞碎片以及分泌抗炎物質(zhì)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等，有利于神經(jīng)元再生和死亡周邊區(qū)神經(jīng)元的存活，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。但有實(shí)驗(yàn)表明被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)CNS也具有損傷作用，即激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生一些細(xì)胞因子，然后細(xì)胞因子如IL－1又可進(jìn)一步刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生更多的神經(jīng)毒性自由基以及炎癥因子，對(duì)CNS產(chǎn)生損傷。因神經(jīng)元不能再生，其損傷作用顯然更為有害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠腦缺血－再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，增生、肥大，S－100蛋白表達(dá)增加，EGB治療組與缺血2h再灌注24h組比較細(xì)胞數(shù)量減少，突起較長(zhǎng)，S－100陽性細(xì)胞表達(dá)減弱，表明EGB可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活，減輕其對(duì)CNS的進(jìn)一步損傷，從而對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。

[1]Gehrmam J，Matsumoto Y，Kreutzberg GW.Microglia：intrinsic immuneffector cell of the brain[J].Brain Res Rev，1995，20：269－287

[2]劉士民，郭玉璞.腦缺血的膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：腦血管疾病分冊(cè)，1999，7（2）：67－70

[3]王淑英，李慧玲，李文，等.EGB對(duì)大鼠腦缺血－再灌注損傷的作用[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2012，7（9）：244－246

[4]王淑英，斗章，姜曉藝，等.銀杏葉提取物對(duì)大鼠局灶性腦缺血－再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32（12）：2539－2540

[5]王淑英，王小江，金維哲，等.銀杏葉提取物（EGB）對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后SOD活性和MDA含量的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2004，27（6）：29

[6]Kuluz JW，Prado RJ，Dietrich D，et al.The effect of nitric oxide synthase inhibition on infarct volume after reversible focal ischemia in conscious rats[J].Stroke，1993，24：2023