李延武,李卓成

(廣東省深圳市第二人民醫(yī)院檢驗科,廣東深圳,518035)

拉米夫定是臨床治療乙肝或抗HBV的新型 藥物,為核苷酸類似物及反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,能夠有效地對HBV的復(fù)制過程產(chǎn)生明顯地抑制作用。然而,長期地服用拉米夫定,會產(chǎn)生拉米夫定耐藥性[1-2]。臨床研究[2-3]證實,拉米夫定耐藥是HBV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)發(fā)生突變,尤其在HBV聚合酶基因P基因的活性區(qū)域氨基酸位點發(fā)生變異最為常見。本研究對 2007年8月—2012年8月本院收治的356例乙型肝炎患者的臨床資料進行回顧性分析,采用熒光定量PCR結(jié)合DNA分子測序技術(shù)對其耐藥菌株突變情況進行檢測和分析,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2007年8月—2012年8月本院收治的乙型肝炎患者356例,其中男221例,女135例;年齡11～75歲,平均(47.02±11.08)歲;診斷均符合2000年全國傳染病及寄生蟲病分會與肝病學(xué)分會修訂的病毒性肝炎預(yù)防與治療方案的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[5],服用拉米夫定之前,經(jīng)檢測血清中ALT>80 μ g/L(正 常 值 約 為 40 μ g/L),HBV DNA>106copies/mL,拉米夫定治療的劑量為80～100 mg/d,排除其他因素引起的肝功損害。

1.2 血清標(biāo)志物與肝功能檢測

血清標(biāo)志物主要由意大利Alisei全自動酶檢測分析儀進行分析、測定,試劑為廈門新創(chuàng)公司所提供,肝功能采用 Beckmann生化分析檢測儀(Beckmann公司所提供,檢測范圍為4.2E+02～4.2E+08[6])。

1.3 HBV P區(qū)PCR擴增

PCR反應(yīng)體系為 25 μ L, 其中有 4 μ L 為HBV-DNA 模 板 ,1 μ L Taq DNA 聚 合 酶 ,為2.5U/μ L,2.5μ L 10 ×PCR緩沖 液 ,2μ L的2.5 mM dNTP,1.5 μ L 的HBV-F1 引物,濃度為10 μ mol/L,1.5 μ L HBV-R1, 濃度為 10 μ mol/L(具體見表1)。擴增條件為:94℃預(yù)變性,時間為5 min,于94℃溫度條件下邊線15 s,60℃溫度條件下退火35 s(采集熒光),40個循環(huán),采用美國ABI StepOne熒光定量PCR擴增分析儀進行檢測、分析[7]。

表1 HBV引物探針序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究中的數(shù)據(jù)均由SPSS 15.0軟件加以統(tǒng)計及分析,計量數(shù)據(jù)采用卡方檢驗的方法加以計算,計數(shù)資料采用配對檢驗的方法加以計算,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 治療2～18個月后HBV-DNA、ALT及HBeAg檢測結(jié)果

拉米夫定治療 2、6、12、18 個月后 HBVDNA含量、ALT水平均逐漸下降(P<0.05或P<0.01);轉(zhuǎn)陰率、HBeAg復(fù)常率及轉(zhuǎn)陰率逐漸升高。見表2。

2.2 門診乙肝患者與經(jīng)拉米夫定治療后乙肝患者HBV基因型之間的關(guān)系

門診檢查的乙肝患者與經(jīng)拉米夫定治療患者的HBV基因型無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.3 經(jīng)拉米夫定治療后乙肝患者HBV P區(qū)耐藥突變點結(jié)果

經(jīng)拉米夫定治療后,氨基酸位點為204的患者人數(shù)最多(21.91%),位點為213的最少(2.25%),見表4。

表2 拉米夫定治療后HBV-DNA、ALT及HBeAg檢測結(jié)果[n(%)]

表3 門診乙肝患者與經(jīng)拉米夫定治療后乙肝患者HBV基因型之間的關(guān)系[n(%)]

表4 經(jīng)拉米夫定治療后乙肝患者HBV P區(qū)耐藥突變點結(jié)果[n=356,n(%)]

3 討 論

拉米夫定是全新一代核苷類似物,能夠有效地抑制HBV反轉(zhuǎn)錄酶的表達,其抑制HBV復(fù)制作用的機制是藥物在細(xì)胞內(nèi)磷酸化之后再與脫氧胞嘧啶核苷之間進行競爭,然后再進入至合成中的eDNA鏈[8-9],使其不能夠繼續(xù)地延伸而逐漸終止復(fù)制過程,從而在很大程度上阻斷了HBV復(fù)制中的反轉(zhuǎn)錄(RNA-DNA)過程,是目前普遍認(rèn)為的臨床治療慢性乙肝的安全、有效的藥物。本研究中,治療前及治療后2、6、12及18個月HBV-DNA的含量從(7.22±0.33)copies/mL逐漸降低至(4.02±0.11)copies/mL,治療后各時點與治療前HBV-DNA比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);ALT水平也隨著治療時間的延長而逐漸降低,由治療前的(177.19±44.30)U/L逐漸降低至18個月時的(85.56±11.78)U/L,治療后各時點與治療前相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);HBeAg復(fù)常率與轉(zhuǎn)陰率也逐漸上升。

本研究結(jié)果表明,門診乙肝患者HBV B型、C型及D型構(gòu)成比分別為20.00%、70.83%、9.17%,經(jīng)拉米夫定治療患者分別為30.90%、59.55%、9.55%,各個基因型相比,2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),此結(jié)果與Zoulim F等[10]的研究結(jié)果一致。大量實驗研究[11-12]證實,發(fā)生rtM204I變異或者 rt180M/rtM204V雙變異的對拉米夫定耐藥的HBV病毒對替比夫定抗病毒效果降低超過約1000倍。本研究所選擇的這些經(jīng)拉米夫定治療之后的乙肝患者均為拉米夫定治療超過1年的住院患者,這就說明了經(jīng)過拉米夫定治療之后,患者的耐藥性較為明顯,此時進行拉米夫定耐藥檢測的價值較大[13]。這些患者之中存在著比較廣泛的多位點同時突變的例子,基因序列測定檢測的為容易發(fā)生突變區(qū)域的完整序列[14-15]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)拉米夫定治療后,氨基酸位點為204的患者數(shù)最多占21.91%。

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