曹致超,周曉霞,龐樹華,譚家成,蘇佩清

(1.揚州大學臨床醫(yī)學院,江蘇揚州,225001;2.揚州市中醫(yī)院,江蘇揚州,225002)

黃芩莖葉總黃酮(SSTF)為黃芩莖葉的提取物,其主要成分為黃酮類化合物。藥理學研究[1-5]表明,SSTF有降壓、抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂等廣泛的藥理活性。本研究利用細胞培養(yǎng)技術(shù),用過氧化氫(H2O2)構(gòu)建人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)氧化損傷模型,觀察SSTF對HUVEC氧化損傷的保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑

黃芩莖葉總黃酮(由承德醫(yī)學院中藥研究所提供,批號:010408);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司產(chǎn)品);小牛血清(山東銀香偉業(yè)生物有限公司產(chǎn)品);胰蛋白酶(美國Sigma公司產(chǎn)品);MTT(美國Sigma公司產(chǎn)品);Bcl-2,山羊抗小鼠lgGHRP(武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品);Annexin V-FITC/PI試劑盒(南京凱基生物工程有限公司產(chǎn)品);LDH、MDA、SOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。人臍靜脈內(nèi)皮細胞株購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HUVECs的培養(yǎng):人臍靜脈內(nèi)皮細胞株,復蘇后用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,放入CO2孵箱中培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2、95%空氣,保持一定濕度),鏡下觀察細胞生長情況,根據(jù)細胞生長情況,給予換液;約 2～3 d,細胞生長匯合成單層,用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶3傳代。實驗過程中采用生長匯合成單層的內(nèi)皮細胞。

1.2.2 實驗分組:對照組:只加相應體積培養(yǎng)液;H2O2損傷模型組:在培養(yǎng)液中加入 2 mmol/L H2O2誘導損傷4 h;藥物保護組:依次為SSTF低濃度組、SSTF中濃度組、SSTF高濃度組。先分別在培養(yǎng)液中加入終濃度為100、200、400mg/L SSTF孵育24 h,再加入2 mmol/L H2O2誘導損傷4 h;維生素C(VitC)陽性對照組:在培養(yǎng)液中先加入終濃度為20mg/LVitC孵育24h,再加入2 mmol/L H2O2誘導損傷4 h。

1.2.3 MTT法檢測HUVEC活力:實驗結(jié)果以MT T(OD)值以及細胞生長抑制率表示。細胞生長抑制率計算公式:(對照組OD-實驗組OD)/對照組OD×100%

1.2.4 LDH、SOD和MDA的測定:按實驗分組所述方法處理后,收集細胞培養(yǎng)上清液,分別按LDH、MDA、SOD測定試劑盒(南京建成生物工程研究所產(chǎn)品)中說明書上所述的方法分別檢測LDH、SOD的活性和MDA的含量。

1.2.5 細胞凋亡率以及凋亡抑制蛋白Bcl-2的檢測:按實驗分組所述方法培養(yǎng)和處理細胞,按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書上的操作步驟收集細胞和加試劑處理,最后經(jīng)流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率;同時,收集各組細胞,提取各組細胞中的蛋白樣品并且測定蛋白含量,最后采用western-blot法測定各組細胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達情況。

2 結(jié) 果

2.1 SSTF對氧化損傷HUVEC細胞活力、細胞培養(yǎng)液中LDH活性的影響

H2O2處理HUVEC后其細胞活力較正常組HUVEC細胞活力下降,細胞培養(yǎng)液中LDH活性明顯增加(P<0.01);與H2O2組比較,SSTF中、高組細胞活力明顯增高(P<0.05或P<0.01),而細胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 SSTF對氧化損傷HUVEC細胞活力、培養(yǎng)上清液中LDH活性的影響( ±s)

表1 SSTF對氧化損傷HUVEC細胞活力、培養(yǎng)上清液中LDH活性的影響( ±s)

與H2O2損傷組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與對照組比較,##P<0.01。

組別 OD IR/% LDH/(U/L)正常對照組 0.462±0.057 0.0 803.03±21.43 H2O2損傷組 0.264±0.035## 42.9 1212.10±42.85##SSTF低濃度組 0.281±0.021 39.2954.54±21.43＊SSTF中濃度組 0.301±0.029＊ 34.8833.33±107.13＊＊SSTF高濃度組 0.329±0.037＊＊ 28.8560.60±192.85＊＊VitC組 0.297±0.025＊ 35.7954.50±421.43＊

2

.2 SSTF對氧化損傷HUVEC培養(yǎng)上清液中SOD活性和MDA含量的影響

H2O2處理HUVEC后,其SOD活性較正常HUVEC組的降低,MDA含量明顯升高(P<0.05或P<0.01);與H2O2損傷組比較,SSTF低、中、高組HUVEC細胞培養(yǎng)上清液中SOD活性增高,而MDA含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表 2。

表2 SSTF對氧化損傷HUVEC培養(yǎng)液中SOD活性、MDA含量的影響( ±s)

表2 SSTF對氧化損傷HUVEC培養(yǎng)液中SOD活性、MDA含量的影響( ±s)

與H2O2損傷組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 SOD/(U/mL)MDA/(nmol/mL)正常對照組 6.54±0.20 0.44±0.11 H2O2損傷組 5.84±0.15# 0.89±0.11##SSTF低濃度組 6.79±0.40＊＊ 0.63±0.06＊SSTF中濃度組 7.14±0.20＊＊ 0.44±0.00＊＊SSTF高濃度組 7.61±0.02＊＊ 0.34±0.05＊＊VitC組 6.89±0.15＊＊ 0.15±0.00＊＊

2.3 SSTF對氧化損傷HUVEC的凋亡率、凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平的影響

H2O2處理HUVEC后其細胞凋亡率明顯增加,Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.01);與H2O2損傷組比較,SSTF高濃度組細胞凋亡率明顯下降(P<0.01),SSTF低、中、高組凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平明顯增高(P<0.01)。見圖1、2及表 3。

圖1 SSTF對氧化損傷HUVEC細胞凋亡率的影響

圖2 SSTF對氧化損傷HUVEC細胞Bcl-2蛋白表達的影響

表3 SSTF對氧化損傷HUVEC的凋亡率、Bcl-2表達水平的影響( ±s)

表3 SSTF對氧化損傷HUVEC的凋亡率、Bcl-2表達水平的影響( ±s)

與H2O2損傷組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 細胞凋亡率/% Bcl-2(IOD)正常對照組 4.35±0.76 797.80±611.71 H2O2損傷組 58.43±2.04## 201.50±225.92#SSTF低濃度組 539.60±158.78＊SSTF中濃度組 603.24±15.78＊SSTF高濃度組 28.78±1.57＊＊ 746.02±37.93＊VitC組 18.90±1.80＊＊ 305.73± 28.94

3 討 論

血管內(nèi)皮細胞覆蓋于血管內(nèi)膜表面,直接與循環(huán)血液接觸,因此很容易受到血液中活性物質(zhì),特別是自由基以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的影響。內(nèi)皮細胞功能損傷是多種血管性疾病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。造成血管內(nèi)皮細胞損傷的因素有很多,其中氧化應激是造成血管內(nèi)皮損傷的較為重要的因素之一[7-8],采取抗氧化應激來保護血管內(nèi)皮細胞功能,是防治血管性疾病的著力點之一。現(xiàn)階段的抗氧化藥物大多為化學合成,其數(shù)量和效果非常有限,且存在一定的毒性、致畸性和潛在致癌性。因此,篩選有效、無毒的自由基清除劑來逐漸取代這些化學合成的抗氧化劑具有重大的現(xiàn)實意義。人們先后從植物中提取許多具有清除自由基能力的天然產(chǎn)物,其中黃酮類化合物就是其中活性較強的一類。周曉慧等[11]研究證實SSTF通過清除氧自由基保護O2-損傷的心肌細胞,降低H2O2導致的培養(yǎng)心肌細胞的凋亡率,SSTF對心肌細胞的保護效應可能與其促進Bcl-2蛋白高表達,抑制Bax蛋白的表達從而抑制心肌細胞凋亡有關(guān)。SSTF對培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷有明顯的保護作用,其機制可能與其抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)[9-12],而關(guān)于SSTF對氧化損傷的血管內(nèi)皮細胞的保護作用及其機制的研究,目前尚未見有報道。

H2O2可直接作用于細胞膜脂質(zhì),造成脂質(zhì)過氧化反應,造成細胞膜的損傷,細胞活力值(MTT法)明顯降低,細胞上清液中MDA含量和 LDH活性明顯增加,細胞凋亡率明顯增加,而SOD活性明顯降低。其中MDA含量的高低可以反映脂質(zhì)過氧化反映的嚴重程度,細胞活力值的大小、LDH活性的高低是反映細胞受損傷程度的非常靈敏的指標。SOD活性的高低可以反應機體抗氧化反應的能力。

本研究結(jié)果顯示,SSTF能減輕H2O2對HUVEC的損傷作用,降低細胞上清液中MDA的含量和LDH活性,增加細胞上清液中SOD的活性,降低H2O2導致的培養(yǎng)HUVEC的凋亡率,其機制可能與上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達水平有關(guān)。

[1]趙連科,佟繼明.黃芩莖葉總黃酮降壓作用的實驗研究[J].承德醫(yī)學院學報,1993,10(1):7.

[2]周曉慧,楊鶴梅,馬衛(wèi)軍,等.黃芩莖葉總黃酮對培養(yǎng)心肌細胞H2O2損傷超微結(jié)構(gòu)的影響[J].承德醫(yī)學院學報,2005,2(22):91.

[3]鄧淑華,王鴻梅,劉艷華.黃芩莖葉總黃酮抗菌作用的實驗研究[J].承德醫(yī)學院學報,2008,3(25):324.

[4]劉智,周曉霞,蘇佩清,等.黃芩莖葉總黃酮治療 2型糖尿病性高脂血癥大鼠的實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,1(20):5.

[5]周曉霞,尤翠蘭,蘇佩清,等.黃芩莖葉總黃酮對高脂血癥大鼠脂代謝的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,2(20):99.

[6]Cline D B,Pollak E S,Buck C A,et al.Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders[J].Blood,1998,91:3527.

[7]Hotter G,Closa D,Prats N,et al.Free radical enhancement promotes leukocyte recruitment through a PAF and LTB4 dependent mechanism[J].Free Radic Biol Med,1997,22:947.

[8]Lander H M.An essential role for free radicals and derived species in signal transduction[J].FASEB J,1997,11:118.

[9]周曉慧.黃芩莖葉總黃酮對培養(yǎng)大鼠心肌細胞自由基損傷的保護作用[J].四川中醫(yī),2005,3(23):23.

[10]劉永平.黃芩莖葉總黃酮對過氧化氫誘導的心肌細胞損傷的保護作用[J].天津醫(yī)藥,2008,11(36):885.

[11]周曉慧.黃芩莖葉總黃酮對H2O2誘導的心肌細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2及Bax表達的影響[J].廣東醫(yī)學,2007,10(28):1590.

[12]李素婷.黃芩莖葉總黃酮對原代培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷的保護作用[J].時珍國醫(yī)國藥,2007,3(18):685.