張社民，溫 濤，郝云鵬，張瑞琴

(1．山西省芮城縣畜牧獸醫(yī)局，山西芮城 044600;2．吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062;3．太原鋼鐵公司養(yǎng)殖場(chǎng)，太原 030003)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種以呼吸障礙及懷孕母豬流產(chǎn)為主要特征的疾病，在我國(guó)時(shí)有發(fā)生，引起了極大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。目前，針對(duì)該病主要采用抗原抗體篩查、疫苗接種等方式予以防控。

PRRSV的血清學(xué)診斷方法較大程度上受到抗原影響，早在1997年，Cho等［2］發(fā)現(xiàn)不同的毒株制備的抗原對(duì)于所制備的ELISA試劑盒的檢測(cè)廣度影響較大，其中利用PRRSV89－46448株制備的抗原包被ELISA較其他毒株(LHVA－93－3，PA－8，93－44927，932－24025B，GH －6，MN －1B，LV)效果最佳。除ELISA外，PRRSV抗體檢測(cè)方法還有彩色免疫金銀染色法及乳膠凝集試驗(yàn)，但因敏感度和定量方面的問(wèn)題，導(dǎo)致其應(yīng)用較少［3－4］。PRRSV抗體檢測(cè)方法主要的分析對(duì)象是PRRSV的M、N、GP5蛋白，由于上述蛋白所產(chǎn)生的抗體與不同毒株結(jié)合的特異性并不十分清楚，相應(yīng)檢測(cè)方法的臨床意義并不明確，無(wú)法依其結(jié)果指導(dǎo)生產(chǎn)。1977年Tsuji等首次提出并驗(yàn)證了化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)，并已成功應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域［5－7］。但將CLIA與ELISA結(jié)合應(yīng)用于檢測(cè)，尚未見報(bào)道。

為了能準(zhǔn)確檢測(cè)PRRSV抗體，進(jìn)一步了解病毒的感染規(guī)律，本研究根據(jù)雙抗原夾心ELISA檢測(cè)方法，結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系建立了檢測(cè)血清中PRRSV抗體與疾病相關(guān)性的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法(CLEIA)。

1 材料

1．1 血清 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清為本實(shí)驗(yàn)室研制，保存于－20℃;待檢血清為從當(dāng)?shù)?個(gè)規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)送檢的260份豬血清，置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1．2 抗原 GST－N重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)并純化，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 主要試劑 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的重組核衣殼蛋白由北京博邁德科技發(fā)展有限公司提供;TMB底物顯色液由北京佰億新創(chuàng)科技有限公司提供;PriClin300、Tween20由Sigma公司提供。

1．4 主要儀器 AUY－120型電子天平，日本島津儀器系統(tǒng)有限公司;BHP9504型微孔板發(fā)光分析儀，濱松光子有限公司;微量加樣器，芬蘭Labsystems公司;單條可拆96孔發(fā)光板，深圳金燦華公司;GB11241－89型水溫箱，北京市醫(yī)療設(shè)備廠;DELTA 320 pH計(jì)，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司。

2 方法

2．1 CLEIA試驗(yàn)步驟 本試驗(yàn)采用酶促化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的方法，以純化后的重組N蛋白一部分作為包被抗原，以HRP標(biāo)記的N蛋白一部分為標(biāo)記抗原，采用雙抗原夾心一步法的反應(yīng)模式。

2．2 CLEIA工作條件的優(yōu)化 包括包被液的選擇、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的選擇、包被抗原濃度的選擇、最佳反應(yīng)體系的選擇、酶標(biāo)記抗原最佳工作時(shí)間的選擇。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 將確定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成0(S0)、5(S1)、10(S2)、25(S3)、50(S4)、100(S5)ng/mL五個(gè)濃度點(diǎn)，按CLEIA工作流程，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定自配標(biāo)準(zhǔn)品各點(diǎn)濃度值，采用計(jì)算測(cè)定值與標(biāo)示值的平均比值的方法來(lái)進(jìn)行校對(duì)。同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品與相應(yīng)濃度的樣品進(jìn)行平行性分析測(cè)定，做線性擬合時(shí)，各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)發(fā)光值減去S0發(fā)光值，然后與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度值進(jìn)行雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型(Log X－Log Y)擬合。

2．4 特異性試驗(yàn)

2．4．1 阻斷試驗(yàn) 觀察PRRS血清阻斷性試驗(yàn)，判定標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為:經(jīng)過(guò)PRRS病毒重組抗原阻斷的陽(yáng)性血清的OD值比未阻斷的陽(yáng)性血清的OD值減小，而陰性血清的OD值基本上沒(méi)有發(fā)生變化。隨著血清稀釋倍數(shù)的增大，阻斷后的陽(yáng)性血清的OD值逐漸與陰性血清的OD值接近，當(dāng)血清稀釋到160倍，可以達(dá)到完全阻斷。

2．4．2 特異性交叉反應(yīng)試驗(yàn) 用最適的條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，分別將引起豬繁殖障礙的四種主要疾病豬瘟、偽狂犬病、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型的陽(yáng)性血清作為待檢樣品，同時(shí)做PRRSV陽(yáng)性和陰性對(duì)照，根據(jù)OD450值進(jìn)行結(jié)果的判定。

2．5 重復(fù)性試驗(yàn)

2．5．1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批制備的重組蛋白包被反應(yīng)板，取10份抗體水平不同的血清，在同一時(shí)間、同一條件下，同一批試驗(yàn)中按雙抗原夾心ELISA操作程序進(jìn)行測(cè)定，每份血樣平行做5孔，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同血清樣品的變異系數(shù)不超過(guò)10%。

2．5．2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)選取3塊不同批次包被的酶標(biāo)板，在相同條件下檢測(cè)8份抗體水平不同的血清樣品，按雙抗原夾心ELISA操作程序進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算同一份血清樣品在不同批次間OD值的變異系數(shù)來(lái)檢測(cè)批間檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

3 結(jié)果

3．1 包被緩沖液的確定 按CLEIA操作步驟，選擇3種緩沖液，即pH 4．8的檸檬酸鹽緩沖液、pH 7．4的磷酸緩沖液及pH 9．6的碳酸緩沖液，稀釋包被抗原，其他條件不變。三種包被緩沖液S0、S5的發(fā)光值及S5/S0的值見表1。

表1 不同包被緩沖液的S0、S5的發(fā)光值及S5/S0的值

由表1可以得出，以檸檬酸鹽為包被緩沖液時(shí)，其S0點(diǎn)的發(fā)光值明顯低于其他包被液，且S5/S0的值明顯高于其他包被緩沖液，因此，選擇檸檬酸鹽作為包被緩沖液。

3．2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的確定 按CLEIA操作步驟，選擇3種稀釋液，即馬血清、山羊血清、牛血清，稀釋抗原，其他條件不變。三種標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液健全性試驗(yàn)結(jié)果見圖1。三種標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液S0、S5的發(fā)光值及S5/S0的值見表2。

圖1 不同標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋后抗原濃度

表2 不同標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的S0、S5的發(fā)光值及S5/S0的比值

由圖1可以看出，用馬血清稀釋的抗體時(shí)，抗體濃度與稀釋倍數(shù)的相關(guān)性明顯好于山羊血清和牛血清。同時(shí)，由表2可以看出，用馬血清稀釋的抗體后，其S0點(diǎn)發(fā)光值低于其他稀釋血清，S5/S0值也明顯高于另外兩種血清，因此，選擇馬血清作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

3．3 包被濃度的確定 按CLEIA操作步驟，根據(jù)確定的最佳包被液將抗原分別稀釋為0．5、1、2 μg/mL，其他條件不變，根據(jù)S5/S0的值確定最佳包被濃度。三個(gè)濃度的包被緩沖液S0、S5的發(fā)光值及S5/S0的值見表3，由表3可以看出，當(dāng)包被濃度為1μg/mL，其S5發(fā)光值達(dá)到最大，且S5/S0也明顯高于其他濃度，因此，選擇1μg/mL作為包被濃度。

表3 不同濃度的包被緩沖液S0、S5的發(fā)光值及S5/S0的值

3．4 酶標(biāo)記抗原工作濃度的確定 按CLEIA工作流程，將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗原分別以1∶5000、1 ∶10000、1 ∶20000 倍稀釋，其他條件不變。三個(gè)工作濃度的酶標(biāo)抗原的S0、S5的發(fā)光值及S5/S0的值見表4。酶標(biāo)抗原在1∶5000倍的工作濃度下，S5/S0值明顯高于其他兩個(gè)工作濃度，因此，選擇1∶5000倍稀釋作為酶標(biāo)抗原工作濃度。

表4 不同工作濃度的酶標(biāo)抗原的S0、S5的發(fā)光值及S5/S0的值

3．5 最佳反應(yīng)體系的確定 按CLEIA工作流程，分別采用50μL校準(zhǔn)品或待檢品與50μL酶標(biāo)記抗原的反應(yīng)體系，50μL校準(zhǔn)品或待檢品與100μL酶標(biāo)記抗原的反應(yīng)體系，25μL校準(zhǔn)品或待檢品與100μL酶標(biāo)記抗原的反應(yīng)體系，進(jìn)行反應(yīng)，其他條件不變。三種反應(yīng)體系的S0、S5的發(fā)光值、S5/S0的值及線性關(guān)系見表5。在采用50μL校準(zhǔn)品或待檢品與50μL酶標(biāo)記抗原的反應(yīng)體系時(shí)，S5/S0的值及線性關(guān)系明顯好于其他兩個(gè)反應(yīng)體系，因此，選擇50μL校準(zhǔn)品或待檢品與50μL酶標(biāo)記抗原的反應(yīng)體系。

表5 不同反應(yīng)體系的S0、S5的發(fā)光值、S5/S0的比值及線性關(guān)系

3．6 酶標(biāo)記抗原最佳工作時(shí)間的確定 按CLEIA工作流程的三種反應(yīng)體系(3．5項(xiàng))進(jìn)行反應(yīng)，其他條件不變，根據(jù)S5/S0的值和線性關(guān)系確定最佳反應(yīng)體系。三個(gè)酶標(biāo)抗原工作時(shí)間的S0、S5的發(fā)光值、S5/S0的值及線性關(guān)系見表6。酶標(biāo)抗原工作時(shí)間在60 min時(shí)，S5/S0的值及線性關(guān)系明顯好于其他兩個(gè)工作時(shí)間，因此，選擇60 min作為酶標(biāo)抗原工作時(shí)間。

表6 不同酶標(biāo)抗原工作時(shí)間的S0、S5的發(fā)光值、S5/S0的比值及線性關(guān)系

3．7 試劑盒各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)的結(jié)果

3．7．1 劑量－反應(yīng)曲線的線性 于不同試驗(yàn)日分別測(cè)定8個(gè)不同批次試劑的校準(zhǔn)品，用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，計(jì)算其劑量－反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)(r)值。結(jié)果(表7)表明，本試劑盒的線性關(guān)系均保持在0．995以上。

表7 劑量-反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)試驗(yàn)結(jié)果

3．7．2 靈敏度 以S0校準(zhǔn)品進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定，其平均值加上三倍標(biāo)準(zhǔn)差求出所對(duì)應(yīng)的濃度值，分別用不同批次的試劑盒進(jìn)行五次試驗(yàn)，結(jié)果見表8。靈敏度試驗(yàn)應(yīng)不少于3批(包括3批)，本方法測(cè)定五批的靈敏度，結(jié)果為0．49ng/mL。

表8 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

3．7．3 精密度

3．7．3．1 分析內(nèi)精密度 配制成低、中、高質(zhì)控血清，在同一批試驗(yàn)中測(cè)定它們的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，計(jì)算出其濃度值，每個(gè)質(zhì)控血清平行做10孔，計(jì)算其變異系數(shù)。分析內(nèi)精密度結(jié)果見表9。由此可以看出本試劑盒對(duì)高、中、低血清的分析內(nèi)精密度均小于10%。

表9 分析內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果

3．7．3．2 分析間精密度 配制成低、中、高質(zhì)控血清，分別用不同批次的試劑盒測(cè)定它們的濃度值，每批平行做10孔，計(jì)算三批的變異系數(shù)，分析間精密度結(jié)果見表10。由此可以看出本試劑盒對(duì)高、中、低血清的分析間精密度均小于12%。

表10 分析間精密度試驗(yàn)結(jié)果

3．7．4 干擾反應(yīng) 在7份已經(jīng)確定值的血樣中分別加入膽紅素、血紅蛋白、甘油三脂、枸櫞酸鈉、EDTA－Na2、肝素、草酸鈉，混勻后用試劑盒檢測(cè)PRRSV濃度，計(jì)算其檢出率。干擾試驗(yàn)的結(jié)果見表11。

3．7．5 HOOK效應(yīng) 利用高濃度的抗體，將抗體濃度倍比增加，直到發(fā)光值隨著抗體濃度的增加而降低時(shí)，得到的抗體濃度為出現(xiàn)HOOK效應(yīng)的濃度。HOOK效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果見表12。由表12可以看出，產(chǎn)生HOOK效應(yīng)時(shí)被測(cè)物的濃度(即被測(cè)物的濃度增加其 RLU值反而降低)在1500ng/mL左右。

表11 干擾試驗(yàn)結(jié)果

表12HOOK效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

3．7．6 穩(wěn)定性 將試劑盒分別在37℃加速破壞5d和10d后，與4℃放置的試劑盒進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果見表13。結(jié)果表明，該藥盒在37℃放置5d和10d后，與4℃放置的試劑盒相比，其變化不顯著，根據(jù)37℃放置1d相當(dāng)于4℃放置40d的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算，可知該試劑盒的有效期不少于12個(gè)月。

表13 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3．7．7 準(zhǔn)確性

用定值的混合血清按不同比例稀釋高濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，得到高、中、低三個(gè)濃度的樣品，然后用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在不同時(shí)間進(jìn)行五次試驗(yàn)，計(jì)算其平均回收率，結(jié)果見表14。由表14可以看出，該試劑盒在檢測(cè)高、中、低三個(gè)濃度樣品的平均回收率均在要求的90% ～110%之間，符合要求。

表14 回收性試驗(yàn)結(jié)果

3．8 試劑盒的應(yīng)用性(本試劑盒與酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)比較) 對(duì)84份血清標(biāo)本，分別用化學(xué)發(fā)光免疫分析法和酶聯(lián)免疫分析法同時(shí)測(cè)定。以本法CLEIA的測(cè)定值為x軸，酶聯(lián)免疫分析法的測(cè)定值為y軸，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得相關(guān)系數(shù)方程式為:Y=1．7398X － 2．1336，相關(guān)系數(shù)為:r=0．9486(圖2)。結(jié)果表明化學(xué)發(fā)光免疫分析法與酶聯(lián)免疫分析法呈高度相關(guān)。

圖2 本法與ELISA的相關(guān)性分析

4 討論

4．1 利用ELISA檢測(cè)PRRSV抗體需解決的問(wèn)題

近年來(lái)，我國(guó)境內(nèi)的PRRSV變異現(xiàn)象十分活躍［8］。目前，臨床上主要用 ELISA方法檢測(cè)PRRSV的抗體。2005年，江云波等利用原核表達(dá)PRRSV GP5及M融合蛋白，建立了ELISA檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)GP5與M蛋白的抗體水平與中和抗體的水平之間線性關(guān)系并不高。同年，吳延功等利用重組PRRSV N蛋白作為抗原包被制備ELISAs試劑盒，具有良好的特異性和敏感性。仝利劍等建立豬藍(lán)耳病病毒抗體雙抗原夾心ELISA方法［9］，夏向榮等也做了相似的工作，但均未就其與中和性抗體的關(guān)系作進(jìn)一步的闡述［10－11］。

4．2 劑量－反應(yīng)曲線的建立與定量分析方法的建立

化學(xué)發(fā)光免疫分析過(guò)程中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即劑量－反應(yīng)曲線。在繪制曲線時(shí)通常以濃度值為橫坐標(biāo)，發(fā)光值為縱坐標(biāo)，用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型做線性擬合劑量－反應(yīng)曲線時(shí)反映檢測(cè)是否準(zhǔn)確，線性相關(guān)系數(shù)R越接近于1，發(fā)光值和濃度值相關(guān)性越強(qiáng)，檢測(cè)的濃度值準(zhǔn)確，反之，則不適合檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，在化學(xué)發(fā)光免疫分析中，相關(guān)系數(shù)R＞0．99才適于檢測(cè)。本研究中，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)所得到的線性關(guān)系(R)均大于0．995，已超過(guò)了國(guó)家規(guī)定的R＞0．99的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

4．3 化學(xué)發(fā)光免疫分析與HOOK效應(yīng)的關(guān)系

HOOK效應(yīng)是在二位點(diǎn)夾心化學(xué)發(fā)光免疫分析中，當(dāng)濃度值高到一定劑量時(shí)，其劑量－反應(yīng)曲線不再呈正比例曲線，而是出現(xiàn)向下彎曲狀，似一只鉤子。雖然此時(shí)的濃度值很高，但是發(fā)光值卻很低，從而使檢測(cè)結(jié)果偏低。這種現(xiàn)象在一步法和兩步法檢測(cè)中均會(huì)出現(xiàn)，只是在一步法中出現(xiàn)較早［12－13］。該現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于抗體濃度過(guò)高，沒(méi)有形成包被抗原－抗體－酶標(biāo)抗原復(fù)合物，而形成了包被抗原－抗體復(fù)合物或酶標(biāo)抗原－抗體復(fù)合物，酶并沒(méi)有聯(lián)接到固相上，在洗板時(shí)將其洗掉，因此檢測(cè)時(shí)發(fā)光值偏低。本試驗(yàn)中對(duì)HOOK效應(yīng)的研究顯示，當(dāng)PRRSV濃度達(dá)到1500 ng/mL左右時(shí)，將出現(xiàn)HOOK效應(yīng)。所以在使用時(shí)，如出現(xiàn)明顯癥狀，但檢測(cè)的濃度值卻很低時(shí)，應(yīng)考慮到HOOK效應(yīng)，將血清用零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)稀釋后再作檢測(cè)以確定其濃度值。

5 結(jié)論

本試劑盒的測(cè)值與酶聯(lián)免疫分析的測(cè)值顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0．9486，說(shuō)明本試劑盒的測(cè)值和酶聯(lián)免疫分析的測(cè)值相當(dāng)，可達(dá)到同等檢測(cè)水平。本試劑盒適用于PRRSV抗體的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查，為豬繁殖與呼吸綜合征的防控提供了一種新的檢測(cè)技術(shù)。

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