戴志紅，蔣 卉，關(guān)孚時(shí)，孫海燕，李 翠，張秀英，張瑞婷，張立春，王在時(shí)

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國(guó)家和地區(qū)均有發(fā)生［1－2］，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報(bào)性疫病［3］，我國(guó)將其劃為一類動(dòng)物傳染?。?］，并納入重大動(dòng)物疫病防控計(jì)劃。兔體中和試驗(yàn)是我國(guó)檢測(cè)豬瘟病毒抗體檢測(cè)的重要法定方法之一，豬瘟兔化弱毒種毒特異性檢驗(yàn)和豬瘟活疫苗鑒別檢驗(yàn)的法定方法也是兔體中和試驗(yàn)［5－6］，但該試驗(yàn)的敏感度、準(zhǔn)確性易受人員、試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等諸多因素的影響。而兔體中和試驗(yàn)用豬瘟病毒陰、陽性血清國(guó)家參考品則是控制和校準(zhǔn)該試驗(yàn)的實(shí)物“標(biāo)尺”。因此，需及時(shí)研制該國(guó)家參考品。

根據(jù) WHO［7］和國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范［8］規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方式有4種:絕對(duì)測(cè)量法、用兩種不同原理的可靠方法測(cè)量法、溯源法、多個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定定值法。本研究按照相關(guān)程序和要求制備兔體中和試驗(yàn)用豬瘟病毒陰、陽性血清國(guó)家參考品，并進(jìn)行了協(xié)作標(biāo)定定值。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 種毒和細(xì)胞 CSFV石門株(F114)、豬瘟兔化弱毒種毒(F480)、PK－15細(xì)胞(F145)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存。

1．1．2 主要試劑和耗材 豬瘟活疫苗(兔源)，由乾元浩生物股份有限公司提供;豬瘟ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，Idexx公司;豬瘟熒光抗體，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備;Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNasin、RNase FreeWater、RNA 提取試劑 TRIzol Reagent、反轉(zhuǎn)錄酶SSⅢ，Invitrogen公司;MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶，Gibico BRL公司;48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，CoStar公司。

1．1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通健康非免疫豬，20 kg左右，購(gòu)于內(nèi)蒙某豬場(chǎng)，經(jīng)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心檢測(cè)為口蹄疫、偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病病原抗體陰性(病原用PCR或RT－PCR方法檢測(cè)，抗體用ELISA方法檢測(cè))，飼養(yǎng)于隔離動(dòng)物室內(nèi)待用;18～22 g小白鼠、1．5～3 kg日本大耳白兔、350～400 g豚鼠，均為清潔級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1．2 方法

1．2．1 免疫原制備 按文獻(xiàn)方法［5］在強(qiáng)毒隔離動(dòng)物室制備，－20℃以下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 候選物制備

1．2．2．1 陰、陽性血清制備 將非免疫豬頸動(dòng)脈采血致死，按常規(guī)方法分離制備陰性血清;將非免疫豬免疫豬瘟兔化弱毒疫苗2頭份，3周后采血樣分離血清，經(jīng)豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)≥1∶2，將其頸動(dòng)脈采血致死，按常規(guī)方法分離制備弱陽性血清;按文獻(xiàn)方法［5］在強(qiáng)毒隔離動(dòng)物室強(qiáng)化免疫動(dòng)物后，將其頸動(dòng)脈采血致死，按常規(guī)方法分離制備強(qiáng)陽性血清。所有血清－20℃以下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2．2 血清過濾、分裝、凍干、熔封 將3亞批血清分別先經(jīng)0．4μm無菌濾膜加壓過濾，再經(jīng)0．22μm無菌濾膜加壓過濾;隨后用瓶頸分液器(分裝精度為±0．01 mL)無菌分裝至1 mL滅菌長(zhǎng)安瓿，分裝過程中用攪拌子低速攪拌血清;按常規(guī)方法凍干、抽真空、熔封。將陰性、弱陽性、強(qiáng)陽性血清批號(hào)分別確定為200905－1、200905－2、200905－3

1．3 候選物檢驗(yàn)

1．3．1 物理性狀 每亞批隨機(jī)抽取5支樣品，觀察顏色和形狀，再打開安瓿加去離子水(可以低速渦旋或用移液器輕輕吹打)，記錄溶解所需時(shí)間和溶解后性狀。

1．3．2 無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、真空度測(cè)定 隨機(jī)抽取規(guī)定數(shù)量的樣品，按文獻(xiàn)［6］中的相應(yīng)方法進(jìn)行。

1．3．3 剩余水分測(cè)定 采用真空干燥法［6］。

1．3．4 均勻性檢驗(yàn) 每亞批隨機(jī)抽取16支血清復(fù)溶，其中1支取樣10 次，其余各支取樣1次［9－10］，用豬瘟病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒一次檢測(cè)所有取樣的 OD450值，再進(jìn)行 t檢驗(yàn)和 F 檢驗(yàn)［11－12］。

1．3．5 保存有效期試驗(yàn) 按文獻(xiàn)［13－15］方法進(jìn)行，隨機(jī)抽取40支血清樣品，分別在25、37、45、56 ℃下保溫，分別于0～24周隨機(jī)抽取1支樣品，按照1∶400、1∶450～1∶800系列稀釋，用豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其效價(jià)(最大陽性稀釋倍數(shù))。將不同溫度下的加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)按公式(1):ln c=ln c0－kt擬合線性回歸方程，求出不同溫度下的k值;再將k值按公式(2):ln k=－Ea/RT+ln A擬合線性回歸方程，求出－20℃下的k值;最后根據(jù)－20℃下的k值及公式(1)，計(jì)算出樣品效價(jià)由初始效價(jià)降低到目標(biāo)效價(jià)所需的時(shí)間，即貯存有效期。

1．3．6 特異性檢測(cè) 每亞批隨機(jī)抽取5支樣品，同一亞批復(fù)溶混合后委托農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心進(jìn)行口蹄疫、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病抗體檢測(cè)(均用ELISA方法進(jìn)行)。另外，將3亞批血清加1 mL生理鹽水復(fù)溶后，分別加入等量已稀釋至100兔體感染量(Rabbit infection dose，RID)/mL的豬瘟兔化弱毒種毒，置15℃中和2 h，期間振搖3次。同時(shí)設(shè)生理鹽水和空白對(duì)照。中和結(jié)束后，分別接種大耳白兔2只，每只耳緣靜脈接種1 mL。按文獻(xiàn)方法［6］測(cè)溫和判定熱反應(yīng)。

1．3．7 殘余 CSFV 檢測(cè) 將200905－2和200905－3亞批血清各隨機(jī)抽取5支樣品，同一批次復(fù)溶混合后按文獻(xiàn)方法［16－17］分別進(jìn)行免疫熒光和套式RT－PCR檢測(cè)，以CSFV兔化弱毒株作陽性對(duì)照，以PBS作陰性對(duì)照。

1．4 協(xié)作標(biāo)定和定值 在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行2次獨(dú)立試驗(yàn)，同時(shí)將樣品分發(fā)至5家單位分別進(jìn)行2次獨(dú)立試驗(yàn)。將200905－1亞批血清不稀釋，200905－2亞批血清1∶4～1∶16倍比稀釋，200905－3亞批血清1∶400～1∶1600倍比稀釋，與等量稀釋至100 RID/mL的豬瘟兔化弱毒種毒混合，置15℃中和2 h，期間振搖 3次;同時(shí)設(shè)立種毒陽性對(duì)照(50 RID/mL)、陰性對(duì)照(3亞批血清的所有稀釋度)和空白對(duì)照(生理鹽水)。中和結(jié)束后，分別接種大耳白兔2只，每只耳緣靜脈接種1mL。按文獻(xiàn)方法［6］測(cè)溫和判定熱反應(yīng)，并計(jì)算血清的中和效價(jià)?；厥账袛?shù)據(jù)，用狄克遜(Dixon)法剔除數(shù)據(jù)中的異常值［11］，再用Excel 2010計(jì)算幾何平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2．1 物理性狀 所有安瓿內(nèi)容物均呈灰白色團(tuán)塊，加去離子水后在10 min之內(nèi)溶解，溶解后為淡黃色澄明液體。

2．2 無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、真空度測(cè)定、均勻性檢驗(yàn)、保存有效期試驗(yàn) 結(jié)果均符合規(guī)定。

2．3 剩余水分測(cè)定 采用真空干燥法對(duì)抽取樣品進(jìn)行了剩余水分測(cè)定，結(jié)果水分含量均低于4%(表1)。

表1 血清剩余水分含量 %

2．4 特異性檢驗(yàn) 3亞批樣品經(jīng)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心檢測(cè)，結(jié)果口蹄疫、偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病ELISA抗體均為陰性。除200905－1血清與種毒中和后引起家兔體溫反應(yīng)外，200905－2、200905－3血清與種毒中和后均不引起家兔體溫反應(yīng)。

2．5 殘余CSFV檢測(cè) 將樣品復(fù)溶后分別接種PK－15細(xì)胞并盲傳3代，再進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果均為陰性;將樣品復(fù)溶后進(jìn)行套式RT－PCR核算檢測(cè)，結(jié)果均為陰性(圖1)。

圖1 套式RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2．6 協(xié)作標(biāo)定 回收所有數(shù)據(jù)，分別計(jì)算血清效價(jià)，經(jīng)狄克遜(Dixon)檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均保留(表2)。

3 討論

兔體中和試驗(yàn)影響因素較多，試驗(yàn)結(jié)果易存在較大誤差，有時(shí)為獲得滿意結(jié)果不得不重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。兔體中和試驗(yàn)用豬瘟陰、陽性血清國(guó)家參考品的使用，則有助于使用單位控制和校準(zhǔn)該試驗(yàn)，分析和查找各自試驗(yàn)的不穩(wěn)定因素，提高該試驗(yàn)的能力和水平。目前我國(guó)豬瘟活疫苗的效力檢驗(yàn)是用兔體實(shí)驗(yàn)測(cè)定兔體感染量來進(jìn)行的，該試驗(yàn)同樣易受人員、環(huán)境、動(dòng)物等因素影響而存在較大誤差。若應(yīng)用該參考品來測(cè)定疫苗的兔體感染量，則可以減少誤差或校準(zhǔn)使用單位的檢驗(yàn)體系。此外，該參考品也可以用于實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證或人員能力比對(duì)等。

表2 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果

［1］ Edwards S，F(xiàn)ukusho A，Lefèvre P C，et al．Classical swine fever:the global situation ［J］．Vet Microbiol，2000，73(2/3):103－119．

［2］ Domenech J，Lubroth J，Eddi C，et al．Regional and international approaches on prevention and control of animal trans boundary and emerging diseases［J］．Ann N Y Acad Sci，2006，1081:90 －107．

［3］ http://www．oie．int/eng/maladies/en_classification2010．htm?e1d7［2010 －1 －4］．

［4］ 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部．中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告(第1125號(hào))［S］．

［5］ 農(nóng)業(yè)部第四屆獸用生物制品規(guī)程委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程(2000年版)［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000．

［6］ 中國(guó)獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸藥典(2010年版三部)［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010．

［7］ World Health Organization．Recommendations for the preparation，characterization and establishment of international and other biological reference standards(revised 2004)．WHO Technical Report Series，No．932，2006．

［8］ 全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理委員會(huì)．一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范(JJG1006－94)［S］．

［9］ VanderVeen A M H，Linsinger T P，Pauwels J．Uncertainty calculations in the certification of reference materials．2．Homogeneity study［J］．Accred Qual Assur，2001，6:26 －30．

［10］ Linsinger T P，Pauwels J，VanderVeen A M H，et al．Homogeneity and stability of referencematerials［J］．Accred Qual Assur，2001，6:20－25．

［11］全 浩．標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其應(yīng)用技術(shù)［M］．北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003．

［12］蔣子剛，顧雪梅．分析測(cè)試中的數(shù)理統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量保證［M］．上海:華東化工學(xué)院出版社，1991．

［13］ Kirkwood T B．Predicting the stability of biological standards and products［J］．Biometrics，1977，33(4):736 － 742．

［14］ Marina CR，F(xiàn)ernando RQ，Luis F，etal．Determination of product shelf life and activation energy for tumor necrosis factor－αin cerebrospinal for tumor necrosis factor－αin cerebrospinal fluid samples［J］．Clin Chem，1996，42(5):670 －674．

［15］ Peleg M，Normand M D，Corradini M G．The arrhenius equation revisited［J］．Crit Rev Food Sci Nutr，2012，52(9):830 －851．

［16］ 戴志紅，趙 耘，謝 磊，等．豬瘟病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)程［A］．獸醫(yī)微生物菌種資源標(biāo)準(zhǔn)化整理整合及共享試點(diǎn)項(xiàng)目組．獸醫(yī)微生物菌種資源描述規(guī)范及技術(shù)規(guī)程［M］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008．

［17］戴志紅，趙 耘，寧宜寶，等．豬瘟病毒FJFQ－39株的毒力鑒定［J］．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(9):694 －698．致謝:金宇保靈生物藥品有限公司趙丹彤、石寶蘭、關(guān)永梅、張慧芳、哈斯，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉景利、馬迪楊、李偉杰，福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司陳慶、張工，南京天邦生物科技有限公司侯軍、高云飛、陶慶園、代志新，廣西麗原生物股份有限公司黃慶南、肖華春等同志參與了協(xié)作標(biāo)定，在此一并表示謝意!