張純萍，沈青春，胡海燕，王 芳，徐士新，寧宜寶，高和義

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

豬肺炎支原體是引起豬支原體肺炎(又稱豬喘氣病)的病原，在規(guī)?；B(yǎng)殖場普遍存在，給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大危害［1］。雖然使用疫苗可以有效地減少感染，但是在飼料和飲水中使用抗生素仍舊為養(yǎng)殖場常用的豬支原體肺炎的防治策略。目前對豬肺炎支原體耐藥性研究的資料很少，主要是由于肺炎支原體生長條件苛刻，生長緩慢，因此其臨床分離甚至培養(yǎng)均異常困難。目前世界各國，包括美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)和歐盟抗菌藥物敏感性檢測委員會(EUCAST)均沒有豬肺炎支原體對抗菌藥物敏感性檢測的相應標準。本研究參考相應文獻［2］，采用宏量肉湯稀釋法，對本實驗室保存和分離的4株豬肺炎支原體進行了10種抗菌藥物的敏感性檢測，以了解其對臨床常用抗菌藥物的敏感性，為豬支原體肺炎的防控提供數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 豬肺炎支原體 共4株，分別為北京(BJ)株、232株、濟南(JN)株和RM48株，均由本實驗室保存。其中BJ株為2009年本實驗室分離;232株為美國引進標準株;JN株分離自20世紀60年代;RM48株為2003年馴化株。

1．1．2 測試抗菌藥物 泰樂菌素、替米考星、林可霉素、頭孢噻呋、磺胺甲惡唑、多西環(huán)素、氟苯尼考和泰妙菌素均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供;四環(huán)素和環(huán)丙沙星購自中國食品藥品檢定研究院。

1．1．3 支原體培養(yǎng)基 根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》中支原體培養(yǎng)基的配制方法［3］配制。

1．2 方法 采用宏量肉湯稀釋法測定豬肺炎支原體對抗生素的敏感性。其中替米考星和泰樂菌素的最終稀釋濃度范圍為0．004～0．5μg/mL，其余8種藥物的最終稀釋濃度范圍均為0．03～4μg/mL。

1．2．1 豬肺炎支原體懸液的配制 根據(jù)Ter Laak等的方法［2］略加改動。將凍存的4株豬肺炎支原體用新鮮配制的培養(yǎng)基進行復蘇和傳代，測定滴度為每毫升109顏色改變單位(CCU)，然后用培養(yǎng)基無菌稀釋至104CCU/mL，作為接種用懸液備用。

1．2．2 不同濃度抗菌藥物溶液的制備 根據(jù)抗菌藥物的含量等進行計算并稱量，然后用相應溶劑［4］分別配制成濃度為 5120μg/mL的儲備液，置－40℃冰箱保存?zhèn)溆?。每種藥物均為8個稀釋濃度。首先將抗菌藥物儲備液用肺炎支原體培養(yǎng)液稀釋至最高稀釋濃度的兩倍:大環(huán)內(nèi)酯類藥物為1μg/mL，其余8種藥物均為8μg/mL。將2 mL最高稀釋濃度的藥物加至第1支無菌小管中，其余7支小管中加入1 mL培養(yǎng)液，從第1管吸取1 mL至第2管中倍比稀釋直至第8管，并從第8管中吸出1 mL廢棄。

1．2．3 耐藥性測定 將104CCU/mL的豬肺炎支原體懸液1 mL加至每一個無菌小管中，此時管中的抗生素濃度相應地稀釋為原來的一半，而每個管中支原體的濃度也變?yōu)?×103CCU/mL。同時設(shè)置陰性和陽性對照管。置于溫箱(36±1)℃培養(yǎng)。于試驗第5天開始觀察結(jié)果，培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)辄S色，說明有肺炎支原體生長。在陽性對照變?yōu)辄S色而陰性對照顏色無明顯變化，而且連續(xù)兩天的觀察結(jié)果相同時，則以顏色沒有明顯變化的最低藥物濃度為肺炎支原體對該藥物的MIC值。

2 結(jié)果

試驗第5天至第7天觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)部分藥物的MIC值發(fā)生了改變:4株菌對泰樂菌素的MIC值均由0．06μg/mL變?yōu)?．12 μg/mL;232株對多西環(huán)素和四環(huán)素的 MIC值分別由第5天的0．06、0．03μg/mL變?yōu)榈?天的 0．12和 0．06 μg/mL;RM48和BJ株對四環(huán)素和多西環(huán)素的MIC值則分別由第5天時的0．06、0．12μg/mL變?yōu)榈?天時的0．12和0．25μg/mL。而在實驗的第7～10天進行觀察時，4株豬肺炎支原體對10種藥物的MIC值均未發(fā)生變化，因此選用第7天的觀察結(jié)果判定本研究中豬肺炎支原體對抗菌藥物的MIC值，具體見表1。

表1 豬肺炎支原體對抗菌藥物的M IC值 μg/m L

由表1可知，4株豬肺炎支原體除了對四環(huán)素類藥物的MIC值有差異外，對其余抗菌藥物的MIC值基本相同。豬肺炎支原體對泰妙菌素和環(huán)丙沙星最為敏感，其MIC值均小于所測試的最低藥物濃度，而對頭孢噻呋和磺胺甲惡唑的MIC值則均高于所測試的最高藥物濃度，對氟苯尼考的MIC值為1～2μg/mL。根據(jù)豬肺炎支原體對藥物的敏感性判定標準［5］，BJ株已經(jīng)對氟苯尼考產(chǎn)生了耐藥性。此外，豬肺炎支原體對同類藥物的MIC值之間也存在差異:4株支原體對泰樂菌素的 MIC值均為0．12 μg/mL，而對替米考星的MIC 值則均 ＞0．5 μg/mL，是對泰樂菌素MIC值的4倍以上;不同支原體分離株對四環(huán)素類藥物的耐藥性也存在差異:JN株對多西環(huán)素和四環(huán)素的MIC值均不高于0．03μg/mL，而BJ株則均在JN株的4倍以上。

3 討論

支原體是一種最小的可獨立生存的微生物，直徑約300 nm。與細菌不同，支原體沒有堅硬的細胞壁，僅有一個三層的膜結(jié)構(gòu)，因此各種作用于細胞壁的藥物對其無效，如β－內(nèi)酰胺類藥物。本實驗中頭孢類抗生素也是作用于細胞壁的藥物，因此其對肺炎支原體的MIC值大于所測試的最高藥物濃度。

一般認為，肺炎支原體對影響蛋白質(zhì)合成的藥物都比較敏感［6］。本研究的結(jié)果基本證實了這一點。其中泰妙菌素和氟喹諾酮類抗生素對豬肺炎支原體的MIC均低于0．03μg/mL，是治療豬肺炎支原體感染的有效抗菌藥物，其余依次為四環(huán)素類藥物(包括四環(huán)素和多西環(huán)素)、林可霉素和泰樂菌素，這與其他研究［2，7］的結(jié)果一致。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是臨床治療兒童和成人肺炎支原體感染的一線抗菌藥物，目前人醫(yī)臨床分離株對該藥物的耐藥性報道日漸增加［8－9］。本實驗僅測試了豬肺炎支原體對兩種獸醫(yī)專用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(替米考星和泰樂菌素)的MIC值，結(jié)果表明其對替米考星的MIC值遠高于對泰樂菌素的MIC值，具體原因有待進一步研究。本研究中BJ株對獸用抗菌藥物氟苯尼考已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性，推測這可能與其在獸醫(yī)臨床上的廣泛使用有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，盡管豬肺炎支原體對所測試抗菌藥物的MIC值不同，但是對多數(shù)藥物均較敏感，有利于獸醫(yī)臨床對豬支原體肺炎的防控。在實際臨床工作中，我們應加強對病原菌的耐藥性監(jiān)測，根據(jù)藥敏結(jié)果合理選用抗菌藥物，以更好地防控疾病的發(fā)生和蔓延。

［1］ 沈青春，寧宜寶，覃青松．豬肺炎支原體的研究進展［J］．中國獸藥雜志，2003，37(6):26 －30．

［2］ Ter Laak E A，Pijpers A，Noordergraaf JH，et al．Comparison of methods for in vitro testing of susceptibility of porcine Mycoplasma species to antimicrobial agents［J］．Antimicrob Agents Chemoth，1991，35(2):228 －233．

［3］ 中華人民共和國獸藥典二OOO年版一部［S］．

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute．Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals，approved standard，third edition，M31 － A3［S］．2008．

［5］ Omer A IKibeida．A comparison ofmethods used tomeasure the in vitro antimicrobial susceptibilities of Mycoplasma species of animal origin［M］．2010．

［6］ David Taylor － Robinson and Christiane Bébéar．Antibiotic susceptibilities of mycoplasmas and treatment of mycoplasmal infections［J］．JAntimicrob Chemoth．1997，40:622 － 630．

［7］ Hannan PC，O＇Hanlon P J，and Rogers N H．In vitro evaluation of various quinolone antibacterial agents against veterinary mycoplasmas and porcine respiratory bacterial pathogens［J］．Res Vet Sci，1989，46:202 －211．

［8］ Zhao F，Lv M，Tao X X，et al．Antibiotic sensitivity of 40 Mycoplasma pneumoniae isolates and molecular analysis ofmacrolideresistant isolates from Beijing，China［J］．Antimicrob Agents Chemoth，2012，56(2):1108 －1109．

［9］ Liu Y，Ye X Y，Zhang H，et al．Characterization of macrolide resistance in Mycoplasma pneumonia isolated from children in Shanghai，China［J］．Diagnostic Microbiology and Infectious Disease，2010，67:355 －358．