張 巖，姜秀云，馬紅霞，高云航，徐鳳宇*

(1．吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春 130118;2．吉林農(nóng)業(yè)大學動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春 130118;3．吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春 130118)

小鵝瘟是由鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的1月齡以內(nèi)雛鵝急性或亞急性敗血性傳染病，發(fā)病率和致死率高，是危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要傳染病之一，被我國列為二類動物疫病。目前，主要采用弱毒苗在產(chǎn)蛋前接種母鵝以及雛鵝肌注高免血清防控該病，但弱毒疫苗存在潛在返祖風險［1］。DNA疫苗等新型疫苗為傳染病的預防開辟了新思路［2］，但單基因的DNA疫苗激發(fā)動物機體的免疫反應一般較弱，有必要配合高效的分子佐劑使用［3］。VP3蛋白是鵝細小病毒的主要衣殼蛋白，也是主要保護性抗原;Hsp65(Heat shock protein 65)是分枝桿菌的優(yōu)勢抗原，也可引導與其融合表達的抗原物質(zhì)在抗原遞呈細胞(APC)內(nèi)經(jīng)MHC－I分子途徑加工遞呈，有效刺激 APC表達 CD86、CD80等分子，起到分子佐劑作用［4］。研究將GPV的VP3和禽分枝桿菌副結核亞種(MAP)的hsp65基因先后連接入真核表達載體pVAX1，構建了真核表達質(zhì)粒pVAX1－VP3和pVAX1－h(huán)sp65－VP3，并在Vero細胞中獲得表達，為Hsp65分子作為佐劑在動物醫(yī)學領域的應用及GPV DNA疫苗的研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 Vero細胞、MAP的hsp65 PCR回收產(chǎn)物、pVAX1質(zhì)粒、pMD18－T－VP3質(zhì)粒、E．coli DH5α感受態(tài)、E．coli JM 109感受態(tài)、兔抗小鵝瘟多克隆抗體由吉林農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)學實驗室保存。DNA凝膠純化回收試劑盒、卡那霉素(Kan)、脂質(zhì)體－2000、FITC標記的山羊抗兔IgG抗體，北京全式金生物公司;MEM細胞培養(yǎng)液、TBD標準胎牛血清，賽墨飛世爾生物化學制品有限公司;Trizol、RNase抑制劑、LA Taq DNA 聚合酶、dNTPs、NheⅠ、Hin d Щ、XbaⅠ、DL2000、DL5000、1 kb DNA Marker、T4 DNA 連接酶、pMD19－T質(zhì)粒，寶生物工程(大連)有限公司;其他化學試劑均為分析純。

1．2 hsp65基因和VP3基因的引物設計 根據(jù)禽分枝桿菌副結核亞種K－10株(GenBank登錄號:NC_002944．2)hsp65基因序列設計特異引物P1h、P2h，兩端分別加入酶切位點NheⅠ和Hin dЩ(下劃線部分)，P2’h的5端添加入linker序列(斜體)。

P1h5’GGCACCATGGCCAAGACAATT 3’;

P2’h5’AGAGCCTCCACC GAAGTCCATGCCACCCA 3’;

P2h5’GCGAGAGCCTCCACCGAA 3’。

根據(jù)鵝細小病毒 B株(GenBank登錄號:U25749．1)、SH 株(GenBank 登錄號:JF333590．1)、SYG61－41(GenBank登錄號:DQ299421．1)等的VP3基因序列設計引物P1v、P2v，兩端分別加入酶切位點Hin dЩ和XbaⅠ(下劃線部分)，P1’v的5’端添加入linker序列(斜體)，引物由生物工程(上海)有限公司合成。

P1’v5’GGTGGAGGCTCTATGGCAGAGGGAGG 3’;

P1v5’TATGGTGGAGGCTCTATGGCA 3’;

P2v5’GGGTTACAGATTTTGAGTTA 3’。

1．3 VP3、hsp65基因的 PCR擴增與回收 VP3 PCR 體系:模板 1 μL，dNTPs 2．5 μL，P1’v0．5 μL，P2v0．5 μL，10 ×LA Taq buffer 2．5μL，LA Taq DNA聚合酶 0．3 μL，ddH2O 17．7 μL。

VP3基因擴增的反應條件:95℃預變性5min;94℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環(huán);72℃延伸10 min。

hsp65 PCR 體系:模板1 μL，dNTPs2．5 μL，P1h0．5 μL，P2’h0．5 μL，2 × LA Taq buffer 2．5 μL，LA Taq DNA 聚合酶 0．3 μL，ddH2O 17．7 μL。

hsp65基因擴增的反應條件:98℃預變性5 min;98℃變性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，用DNA凝膠純化回收試劑盒回收。

1．4 重組表達質(zhì)粒構建 將回收的hsp65、VP3片段分別與 pMD19－T載體連接，構建重組質(zhì)粒pMD19－T－h(huán)sp65和 pMD19－T－VP3，送生物工程(上海)有限公司測序。

將真核表達空載體pVAX1和鑒定正確的pMD19－T－VP3用XbaⅠ和Hin dⅢ雙酶切，回收后用T4DNA連接酶連接，構建pVAX1－VP3，轉化至DH5α感受態(tài)中，提取質(zhì)粒進行鑒定;將鑒定正確的pVAX1－VP3和pMD19－T－h(huán)sp65用NheⅠ和Hin dⅢ雙酶切，回收后用T4DNA連接酶連接，構建pVAX1－h(huán)sp65－VP3，轉化至 DH5α感受態(tài)中，提取質(zhì)粒進行鑒定。

1．5 質(zhì)粒轉染 在6孔細胞培養(yǎng)板的底部放置蓋玻片，制備Vero細胞爬片。待細胞達95%鋪滿蓋玻片時，將重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體－2000按體積比1∶4用無血清的 MEM培養(yǎng)基混勻后，轉染細胞，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。棄去轉染液，更換細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24～42 h，檢測表達產(chǎn)物。

1．6 表達產(chǎn)物檢測

1．6．1 間接免疫熒光鑒定 取出長滿的細胞爬片，晾干后，用 pH7．2的 PBS洗滌 3次;以丙酮(10%)固定細胞3～5 min，PBS洗滌3次;加入兔抗小鵝瘟多克隆抗體(1∶5)，37℃感作2 h后，PBS洗滌3次;加入FITC標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶20)，37℃感作2 h后，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察。

1．6．2 RT－PCR鑒定 收集轉染細胞，提取細胞總RNA。以總RNA為模板，反轉錄合成cDNA。反應體系為:總 RNA10 μL，Oligod(T)1 μL，Rnase Inhibitor 2 μL，AMV buffer 2 μL，AMV 酶 1 μL，dNTPs 4μL。42℃ 1 h，95℃ 5 min。以 cDNA為模板，分別以 P1v、P2v和 P1h、P2h為引物，PCR 擴增，反應條件見1．3。

2 結果

2．1 VP3和hsp65基因克隆結果 經(jīng)測序知分別克隆到了1635 bp(含linker)的hsp65片段和1605 bp(不含Linker序列)的VP3片段，序列分析結果表明，分別與GenBank上登錄的MAP K－10株hsp65基因和GPV SYG61－41毒株的VP3基因的同源性為 99．1%和 99．63%。

2．2 重組質(zhì)粒pVAX1－VP3的鑒定 重組質(zhì)粒pVAX1－VP3經(jīng)XbaⅠ和Hin dⅢ雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見約1．6 kb片段及3．0 kb的載體片段，經(jīng)PCR可擴增出1．6 kb的VP3基因(圖1)，與預期結果相符。

圖1 真核表達載體pVAX1-VP3酶切及PCR鑒定

2．3 重組質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－VP3的鑒定 重組質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－VP3經(jīng)HindⅢ及NheⅠ雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見約1．6 kb及4．6 kb的DNA片段，同時可見未被切開的大小約為6．2 kb大小的DNA片段(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒pVAX1-hsp65-VP3酶切及PCR鑒定

2．4 RT－PCR結果 RT－PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示，A圖中1、2泳道均為VP3基因PCR產(chǎn)物，B圖中1泳道為hsp65基因的PCR產(chǎn)物。可見在1000～2000 bp間均有明顯的條帶，在轉錄水平上證實兩基因在Vero細胞中獲得表達。

圖3 真核表達載體pVAX1-hsp65-VP3和pVAX1-VP3轉染Vero細胞RT-PCR檢測結果

2．5 間接免疫熒光檢測結果 重組質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－VP3和pVAX1－VP3轉染Vero細胞42 h后，經(jīng)丙酮固定。將固定好的細胞爬片經(jīng)間接免疫熒光檢測，結果在熒光顯微鏡下可見細胞表面存在特異熒光，對照組pVAX1空載體轉染的Vero細胞表面未見熒光(圖4)，進一步說明兩基因獲得了表達，且表達產(chǎn)物具有反應原性。

圖4 真核表達載體轉染Vero細胞后間接免疫熒光檢測結果(200×)

3 討論

DNA疫苗可激發(fā)動物機體的細胞和體液免疫應答，作為一種新型疫苗被廣泛應用于各種傳染病及腫瘤的預防制品中，新的包裹技術也正在推進其向臨床應用不斷邁進。

在小鵝瘟DNA疫苗的研制中，韓新鋒等［5］發(fā)現(xiàn)，pcDNA3．1－GPV－VP3肌注小鼠和鵝后能夠誘發(fā)產(chǎn)生抗 GPV的中和抗體;車茜等［6］構建的pcDNA－GPV－VP3能誘導雛鵝產(chǎn)生良好的體液免疫和細胞免疫。說明GPV的VP3蛋白可作為良好的保護性抗原，但單基因的DNA疫苗誘發(fā)的免疫反應較弱，一般配合高效的佐劑使用。Hsp65又稱Cpn 60．2，是分枝桿菌熱休克蛋白家族成員，其佐劑作用可能與其結構相關，因為Rohini等［7］在結核分枝桿菌Hsp65晶體結構中發(fā)現(xiàn)，其形成的二聚體可導致某些疏水區(qū)暴露在蛋白表面，推測與其非特異地結合抗原肽有關;王華等［8］構建的 HSP65－HBV epi融合蛋白有望成為有效的治療性乙肝疫苗;Hsp65在癌癥治療中也發(fā)揮了一定作用，與弗氏佐劑聯(lián)合給藥，免疫7次后，對實驗性小鼠移植黑色素瘤的抑瘤率達73．2%，可能通過介導抗體依賴性細胞毒作用殺傷腫瘤或被病毒感染的靶細胞［9］。所以本研究構建了帶有MAP的hsp65基因的VP3真核表達載體。

在本研究中，擴增目的基因時應用了LA Taq DNA聚合酶，主要考慮到所擴增的hsp65基因片段GC含量高(68．1%)且稍長。另外，在實驗的最初階段，考慮應用重疊延伸PCR技術先將兩基因融合在一起后再連接入真核表達載體，但多次均未能成功，推測可能與兩引物的Tm值相差較多有關，因為有報道稱應用該技術時待融合基因引物的Tm值最好相近或相同［10］，所以改用將兩基因先后連接入表達載體并連接成功。

本研究結果表明，VP3和hsp65同表達載體pVAX1分別連接后，在Vero細胞中能夠表達，為探索鵝細小病毒DNA疫苗的研究奠定了基礎，也為Hsp65的佐劑作用在動物醫(yī)學領域中的應用奠定了基礎。

［1］ 敖禮林．小鵝瘟及其綜合防控措施［J］．福建農(nóng)業(yè)，2011，19(2):36－37．

［2］ 高 光，張 鑫，徐 佳，等．鵝細小病毒VP3基因真核表達載體的構建及其在Vero細胞中表達［J］．中國獸醫(yī)學報，2010，30(3):323－326．

［3］ 侯俊玲，鄭亞東，景志忠，等．DNA疫苗免疫佐劑的研究進展［J］．中國獸醫(yī)科技，2005，35(2):153 －156．

［4］ 楊 鑫，陳福旺，宇 航，等．熱休克蛋白在抗病毒免疫中作用的研究進展［C］．全國動物生理生化第十二次學術交流會論文摘要匯編，畜牧與獸醫(yī)，2012，44:70 －72．

［5］ 韓新峰，程安春，汪銘書，等．小鵝瘟病毒VP3基因疫苗的構建及其誘導小鼠和鵝中和抗體的初報［J］．高技術通訊，2008，18(5):543 －549．

［6］ 車 茜．小鵝瘟病毒VP3基因疫苗誘導雛鵝細胞免疫和體液免疫的研究［D］．雅安，四川農(nóng)業(yè)大學，2007．

［7］ Rohini Qamra，Shekhar C．Mande．Crystal structure of the 65 －kilodalton heat shock protein，chaperonin 60．2，ofmycobacte-rium tuberculosis［J］．Bacteriol，2004，186(23):8105 －8113．

［8］ 王 華．HSP65－HBV多表位融合蛋白乙肝治療性疫苗的研制［D］．長春，吉林大學，2006．

［9］ 謝燕飛，陳 檬，彭淑紅，等．重組卡介苗HSP65抑制小鼠移植黑色素瘤的初步藥效學研究［J］．中國生物工程雜志，2012，32(12):47－51．

［10］徐 芳，姚泉洪，熊愛生，等．重疊延伸PCR技術及其在基因工程上的應用［J］．分子植物育種，2006，4(5):747 －750．