張加軍 邢國(guó)輝 王繼偉 韓培香 李艷萍

（1 山東省日照市中醫(yī)醫(yī)院，日照276800；2 山東省五蓮縣人民醫(yī)院，日照262300；3 山東省五蓮縣叩官中心衛(wèi)生院，日照262305）

原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，化療在肝癌的綜合治療中起著重要作用，但由于多種原因?qū)е履[瘤耐藥性的發(fā)生，導(dǎo)致化療失?。?－2］。川芎嗪 （tetramethypyrazine，TMP）是從中藥川芎中提取的生物堿，它具有多種生物學(xué)活性，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用［3－4］。p53基因是人類惡性腫瘤最常見(jiàn)的突變基因，一旦p53基因發(fā)生突變，其不僅喪失抑癌功能，反而具有了癌基因活性，能促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［5－6］。因此，探索治療肝癌的有效靶向藥物及相關(guān)機(jī)制成為目前研究的熱點(diǎn)。本研究將不同濃度的川芎嗪作用于含有突變型p53的人肝癌HepG2細(xì)胞，以觀察川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其與突變型p53表達(dá)變化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。川芎嗪注射液購(gòu)自黑龍江哈爾濱醫(yī)大藥業(yè)有限公司。Hoechst32258熒光染色試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、MTT均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胎牛血清 （杭州四季青），突變型p53抗體及PV－9000免疫組化試劑盒均為北京中山金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2接種于含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各l×105u／L的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 實(shí)驗(yàn)分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞，按照3×107／L的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積為200μl。待細(xì)胞貼壁后分別加入川芎嗪 （終濃度100、200、400、800mg／L），并設(shè)陰性對(duì)照組 （細(xì)胞正常生長(zhǎng)組），每個(gè)濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，四周加入不含藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液為空白對(duì)照。分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入5g／L的MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，輕輕吸盡上清液，加入二甲基亞砜150μl／每孔，振蕩10min，在酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)測(cè)每孔的光密度值A(chǔ)，并取5孔的平均值，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝（對(duì)照孔A值－實(shí)驗(yàn)孔A值）／對(duì)照孔A值×100%。

1.2.3 Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞制成2×108／L的細(xì)胞懸液，每孔0.5ml，加入放有蓋玻片的24孔板內(nèi)。待細(xì)胞貼壁后分別加入川芎嗪 （終濃度100、200、400、800mg／L），并設(shè)陰性對(duì)照組 （細(xì)胞正常生長(zhǎng)組），每個(gè)濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72h后，取出細(xì)胞爬片，甲醇／冰醋酸固定液固定5min后，加入熒光染液Hoechst33258重懸細(xì)胞，室溫避光1h，PBS沖洗，用抗熒光液封片。判定標(biāo)準(zhǔn)：正常細(xì)胞核為藍(lán)色，凋亡的細(xì)胞核為白色。每片連續(xù)觀察10個(gè)細(xì)胞分布均勻的200倍鏡視野，每視野計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，共500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算其陽(yáng)性率百分?jǐn)?shù)，并取其均值。凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)／（正常細(xì)胞數(shù)＋凋亡細(xì)胞數(shù)）。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)二步法觀察HepG2細(xì)胞的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞制成2×108／L的細(xì)胞懸液，每孔0.5ml，加入放有蓋玻片的24孔板內(nèi)，設(shè)對(duì)照組及不同濃度川芎嗪組，待細(xì)胞貼壁后分別加入川芎嗪 （終濃度100、200、800mg／L），48h后取出細(xì)胞爬片，冷丙酮固定5分鐘，PBS沖洗，按PV－9000試劑盒步驟檢測(cè)突變型p53，DAB顯色，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。用已知陽(yáng)性的乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：突變型p53陽(yáng)性結(jié)果為胞核內(nèi)有棕黃色顆粒出現(xiàn)。采用HPAIS－1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)，檢測(cè)突變型p53陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度值 （A值），以間接反映突變型p53蛋白的表達(dá)量，并取其均值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用 不同濃度川芎嗪作用于HepG2細(xì)胞24h、48h和72h后，細(xì)胞增殖抑制率顯著高于對(duì)照組 （F＝148.392，271.152，346.513，均P＜0.01）；川芎嗪呈時(shí)間劑量依賴性地抑制HepG2細(xì)胞的增殖，同一濃度作用48h其增殖抑制率顯著高于24h，作用72h又顯著高于48h（均P＜0.01，表1）。

表1 不同時(shí)間濃度川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響 （±S，n＝5）

表1 不同時(shí)間濃度川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響 （±S，n＝5）

注：b P＜0.01vs各自細(xì)胞對(duì)照組；d P＜0.01vs各自24h濃度組

川芎嗪（mg／L）24h A值 IR（%）48h A值 IR（%）72h A值 IR（%）對(duì)照組0.749±0.030 0.737±0.030 0.739±0.018 100 0.669±0.020 10.57±3.97b0.652±0.016 11.42±3.60b0.624±0.035 15.30±4.85b 200 0.606±0.014 18.90±4.77b 0.567±0.017 22.94±3.63bd 0.516±0.017 29.96±2.25bd 400 0.541±0.017 27.63±4.60b 0.516±0.014 29.99±2.82bd 0.475±0.019 35.45±2.18bd 800 0.510±0.011 31.75±4.06b 0.456±0.019 38.07±1.89bd 0.371±0.022 49.59±3.26bd

2.2 不同濃度川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度川芎嗪作用于HepG2細(xì)胞24h、48h和72h后，細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組 （F＝462.438，561.124，889.562，均P＜0.01），川芎嗪呈時(shí)間劑量依賴性地促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，同一濃度作用48h其細(xì)胞凋亡率顯著高于24h，作用72h又顯著高于48h（P＜0.01，表2，圖1）。

表2 不同濃度川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響（%，±S，n＝5）

表2 不同濃度川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響（%，±S，n＝5）

注：b P＜0.01vs各自細(xì)胞對(duì)照組；d P＜0.01vs各自24h濃度組

川芎嗪（mg／L）24h 48h 72h對(duì)照組2.03±0.67 2.07±0.12 2.23±0.12 100 4.84±0.51b 5.28±0.72b 4.94±0.38b 200 6.52±0.48b 8.77±0.87bd 12.58±1.31bd 400 8.69±0.93b 14.95±0.94bd 22.36±1.73bd 800 12.18±1.11b 21.19±1.64bd 31.31±2.05bd

圖1 Hoechst染色法檢測(cè)48h后HepG2細(xì)胞凋亡 （×200）A：對(duì)照組；B：100mg／L川芎嗪組；C：800mg／L川芎嗪組

2.3 不同濃度川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞突變型p53蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組突變型p53蛋白呈較高水平表達(dá)，不同濃度川芎嗪作用HepG2細(xì)胞48h后，突變型p53蛋白表達(dá)隨川芎嗪濃度的增加而逐漸降低，與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F＝64.065，P＜0.01，表3，圖2）。

表3 不同濃度川芎嗪作用HepG2細(xì)胞48h后p53蛋白的表達(dá)

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)二步法檢測(cè)HepG2細(xì)胞突變型p53蛋白的表達(dá) （SP×400）A：陰性對(duì)照組；B：對(duì)照組；C：100mg／L川芎嗪組；D：800mg／L川芎嗪組

3 討論

p53基因與人類腫瘤密切相關(guān)，其不僅是最強(qiáng)的抑癌基因，也是人類惡性腫瘤最常見(jiàn)的突變基因。研究表明，多種惡性腫瘤包括肝癌、胃癌、胰腺癌等與p53關(guān)系密切［7－9］，一旦p53基因發(fā)生突變，其不僅喪失抑癌功能，反而具有了癌基因活性，能促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［5－6］。先前，我們?cè)芯堪l(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可能通過(guò)抑制突變型p53的表達(dá)而增強(qiáng)5－氟尿嘧啶對(duì)胃癌細(xì)胞抑制、凋亡作用［9］。因此，尋找以突變型p53為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物成為目前研究的熱點(diǎn)。川芎嗪是從中藥川芎中提取的生物堿，它具有多種生物學(xué)活性，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用［3－4］。川芎嗪能誘導(dǎo)肝癌、肺癌、乳腺癌等一些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［3，4，10］，但其對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的相關(guān)機(jī)制報(bào)道不多。

本研究應(yīng)用不同濃度的川芎嗪作用于p53突變型人肝癌HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，川芎嗪能抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，上述效應(yīng)隨川芎嗪濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，800 mg／L川芎嗪作用HepG2細(xì)胞72h后其抑制率達(dá)49.59%。我們進(jìn)一步應(yīng)用Hoechst染色法觀察了不同濃度的川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著川芎嗪濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，培養(yǎng)72h后其凋亡率高達(dá)31.31%。上述結(jié)果說(shuō)明，川芎嗪可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷作用。我們進(jìn)一步用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察了不同濃度的川芎嗪對(duì)HepG2細(xì)胞突變型p53表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨川芎嗪濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)突變型p53的表達(dá)顯著降低，說(shuō)明川芎嗪的凋亡增強(qiáng)作用與抑制突變型p53的表達(dá)有關(guān)。最近，韓嬌艷等研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以通過(guò)Akt信號(hào)通路影響前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖和凋亡［4］。結(jié)合我們的研究結(jié)果，初步說(shuō)明川芎嗪能抑制HepG2細(xì)胞株的增殖及誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞作用，其機(jī)制可能與其抑制突變型p53的表達(dá)有關(guān)。

我們的研究結(jié)果提示，川芎嗪可能通過(guò)抑制突變型p53的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷作用，為其合理的運(yùn)用于臨床提供理論思路。預(yù)示著川芎嗪在肝癌的治療上有著廣泛的前景，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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