吉妍娟 陳興來 劉晶華

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

0 前言

G-四鏈體是由富含鳥嘌呤（G）的DNA序列通過自身折疊形成的特殊DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)[1]。該結(jié)構(gòu)通常存在于染色體端粒末端及重要原癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域，包括 c-myc、c-kit、bcl-2、kRAS，VEGF、胰島素基因等[2]。研究表明，某些基因的啟動(dòng)子區(qū)域在形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)后，相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)受到了影響；G-四鏈體的形成可能涉及到體內(nèi)的一些重要生理過程，比如細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤發(fā)展等[3]。因此，G-四鏈體被認(rèn)為是小分子抗腫瘤藥物研發(fā)中的新靶點(diǎn)[4]，而從分子水平考察小分子配體與G-四鏈體DNA作用的技術(shù)方法顯得尤為重要。目前，文獻(xiàn)報(bào)道中研究G-四鏈體與小分子配體之間相互作用的方法有十余種：紫外光譜、熒光光譜、圓二色譜、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、表面等離子體共振、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、分子模擬、電噴霧電離質(zhì)譜、核磁共振、X-射線衍射等。本文根據(jù)每種方法的研究目的進(jìn)行分類闡述。

1 G-四鏈體結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)

富含堿基G的DNA序列能夠在特定的離子強(qiáng)度和pH條件下，四條、兩條單鏈之間或一條單鏈內(nèi)的G殘基通過Hoogsteen氫鍵形成G-四分體 (G-quartets)，如圖1所示。幾個(gè)G-四分體堆積到一起形成一種特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即G-四鏈體(G-quadruplex)[5]。富含堿基G的DNA序列在不同的環(huán)境條件下主要形成三種典型的構(gòu)型:平行，反平行和混合G-四鏈體DNA(圖2)。

圖1 四個(gè)鳥嘌呤通過Hoogsten氫鍵連接而成的G-四分體

1.1 圓二色譜

圓二色譜（CD）是目前最方便和最直接獲得DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的技術(shù)，它被廣泛應(yīng)用于研究G-四鏈體的結(jié)構(gòu)變化。平行型G-四鏈體在265 nm附近有正的最大吸收，240 nm有負(fù)的最大吸收；反平行型G-四鏈體在295 nm附近有正最大的吸收，260 nm有負(fù)的最大吸收；混合式的G-四鏈體構(gòu)型則包括了290 nm附近的正吸收以及特征的265 nm附近的肩峰[6]。Jyotirmayee等[7]對含有20個(gè)堿基的c-kit2 DNA序列形成的G-四鏈體DNA的特征CD譜圖分析表明，在K+溶液中DNA主要以平行式的G-四鏈體存在。

圖2 不同G-四鏈體結(jié)構(gòu)

1.2 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）方法近來被廣泛用于研究G-四鏈體DNA與小分子配體相互作用的檢測中。一般而言，分子量不同，分子緊密程度不同的DNA片段在同等電壓的作用下通過聚丙烯酰胺凝膠孔徑的速率是不同的[8]。因此，當(dāng)DNA樣品與小分子配體作用后，誘導(dǎo)形成穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)時(shí)，樣品的電泳遷移率與陰性對照相比就會(huì)有變化。D Sun[9]等人利用聚丙烯凝膠電泳研究了寡聚核苷酸HTG21在無化合物存在下，幾乎以單體的形式存在，隨著化合物的加入，出現(xiàn)了分子間的G-四鏈體二聚體，當(dāng)化合物濃度達(dá)到30 mM時(shí)，二聚體的條帶更加明顯，如圖3所示。

圖3 凝膠電泳分析化合物誘導(dǎo)寡聚核苷酸HTG21的作用

1.3 核磁共振波譜法(NMR法)

對大多數(shù)的寡聚核苷酸所形成的G-四鏈體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)都能夠運(yùn)用NMR譜來進(jìn)行研究，這種技術(shù)能提供關(guān)于四鏈體的構(gòu)象和動(dòng)力學(xué)行為的結(jié)構(gòu)信息[10]。NMR研究利用譜圖中可交換質(zhì)子的共振信號(hào)來分析DNA結(jié)構(gòu)。從緩慢交換的鳥嘌呤亞胺氫的數(shù)量可推測DNA鏈的數(shù)量以及G-四分體的數(shù)量和四鏈體的對稱性。亞胺質(zhì)子化學(xué)位移>12.5 ppm表示W(wǎng)atson-Crick堿基對存在(NH…N氫鍵)；亞胺質(zhì)子化學(xué)位移在10.5-12 ppm表示鳥嘌呤的NH…O氫鍵的存在，即形成了G-四分體[11]。

1.4 X-ray晶體衍射分析法

作為唯一可以對結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的直接方法X-ray晶體衍射技術(shù)，在研究G-四鏈體的結(jié)構(gòu)中扮演著一個(gè)重要角色。該方法能獲得G-四鏈體及G-四鏈體-配體復(fù)合物的精確并詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息[12]。X-ray單晶衍射分析所得到的晶體結(jié)構(gòu)非常明確，它能夠給出金屬離子的位置，小分子配體的結(jié)合位置，以及溝槽的水合作用情況。但是，有些晶體的結(jié)構(gòu)并不一定是溶液中存在的最優(yōu)、最主要的結(jié)構(gòu)，因?yàn)榫Ц衲芎徒Y(jié)晶條件會(huì)影響G-四鏈體結(jié)構(gòu)。

2 研究配體與G-四鏈體結(jié)合力的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

在藥物研發(fā)過程中，針對靶G-四鏈體，為了提高藥物的專一性，發(fā)現(xiàn)特異性較強(qiáng)誘導(dǎo)G-四鏈體形成和使之穩(wěn)定的配體成為研究者們追逐的目標(biāo)。小分子與不同結(jié)構(gòu)的G-四鏈體作用的親和力不同，對G-四鏈體和雙鏈DNA的選擇性親和能力也不同[13]。因此，研究它們的不同親和力的技術(shù)方法是非常重要的。

2.1 表面等離子共振技術(shù)

表面等離子體子共振(SPR)技術(shù)可以不用任何標(biāo)記物來考查小分子化合物與DNA之間特異性的相互作用性質(zhì)，包括它們的結(jié)合，解離速率以及它們的親和力等。該方法將待測的DNA通過共價(jià)結(jié)合方式固定到特定載體上，待測小分子化合物跟隨流動(dòng)相注射流過固化DNA的表面，小分子不斷地與固定化的DNA結(jié)合，通過記錄載體表面的折射應(yīng)答信號(hào) (Ru)，可以給出出相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)（結(jié)合常數(shù)、解離常數(shù)）[14]。因此，可以利用SPR技術(shù)高通量篩選小分子化合物與目標(biāo)G-四鏈體結(jié)合能力。

2.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)，將寡聚核苷酸的一端標(biāo)記一個(gè)熒光供體 (FAM)，另一端標(biāo)記了一個(gè)熒光受體，即熒光淬滅體 (如TAMRA)。方法原理如圖4所示，當(dāng)無序的單鏈在K+存在條件下形成G-四鏈體后，熒光供體和受體之間的距離減小，引起供體激發(fā)能量轉(zhuǎn)移至受體，導(dǎo)致熒光淬滅。反之，當(dāng)四鏈體結(jié)構(gòu)熔解拆散，受體和供體距離增大，這時(shí)就重新產(chǎn)生很高的熒光信號(hào)[15]。因此，可利用這一技術(shù)能用于研究不同G-四鏈體結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性 (熔點(diǎn))，以及評(píng)估不同小分子配體對四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定能力。Jyotirmayee等[16]利用FRET實(shí)驗(yàn)，分析11種化合物對端粒、c-kit四鏈體以及對雙鏈DNA的選擇性識(shí)別能力和穩(wěn)定能力。

圖4 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)原理圖

3 研究配體與G-四鏈體作用模式及計(jì)量關(guān)系的實(shí)驗(yàn)技術(shù)

G-四鏈體DNA具有區(qū)別于雙鏈DNA的特殊幾何構(gòu)造，導(dǎo)致小分子配體與G-四鏈體結(jié)合模式及結(jié)合位點(diǎn)的多樣化。研究表明，G-四鏈體DNA與小分子配體結(jié)合的位點(diǎn)包括G-四分體、溝槽(groove)、loop和離子通道；結(jié)合的模式主要包括：尾部堆積模式、內(nèi)部嵌插模式和溝槽結(jié)合模式[17]（如圖5所示）。為了詳盡探究小分子與G-四鏈體的作用機(jī)制，有必要研發(fā)高效、實(shí)用及準(zhǔn)確的考察配體與G-四鏈體作用模式的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

圖5 小分子配體與G-四鏈體的結(jié)合模式

3.1 電噴霧質(zhì)譜技術(shù)

電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)憑借其快速、靈敏等特點(diǎn)被廣泛用于研究小分子配體與G-四鏈體的共價(jià)或非共價(jià)相互作用。ESI-MS已成功運(yùn)用于DNA與配體作用的化學(xué)計(jì)量學(xué)研究中。Alessandro等[18]采用電噴霧質(zhì)譜法分析得出化合物TAS2C與端粒四鏈體以及雙鏈DK66的結(jié)合比例分別為1:1和1:2，與c-kit序列結(jié)合的計(jì)量比為1:1。

3.2 紫外、熒光光譜技術(shù)

紫外可見吸收光譜（UV-Vis）是研究小分子與DNA相互作用的一種最簡便、最常用的技術(shù)。許多小分子化合物在紫外可見光區(qū)有吸收峰，當(dāng)小分子與DNA發(fā)生相互作用時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其吸收譜帶變寬、吸收峰紅移及減色效應(yīng)。當(dāng)小分子以嵌插方式結(jié)合在DNA堿基對之間時(shí)，紅移和減色效應(yīng)要明顯大于溝槽結(jié)合和靜電結(jié)合作用[19]。熒光光譜法(FS)也是研究小分子化合物與G-四鏈體DNA相互作用的一種簡單技術(shù)手段。熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度會(huì)因?yàn)榕cDNA作用而發(fā)生變化，研究此變化過程可以獲取結(jié)合模式、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和分子間距等信息。小分子化合物嵌插到DNA的G-四分體之間中時(shí)，由于受到DNA堿基疏水環(huán)境的保護(hù)，自身的振動(dòng)將受到抑制，熒光強(qiáng)度將出現(xiàn)一定程度的增強(qiáng)；靜電結(jié)合或溝槽結(jié)合則不會(huì)限制分子的自由旋轉(zhuǎn)，熒光強(qiáng)度沒有明顯變化[20]。

3.3 分子模擬技術(shù)

近年來，隨著計(jì)算機(jī)化學(xué)技術(shù)的發(fā)展、靶標(biāo)DNA晶體結(jié)構(gòu)的快速增長，分子模擬（Molecular modeling)已經(jīng)成為虛擬篩選藥物分子，評(píng)價(jià)配體與受體結(jié)合能力和結(jié)合模式的一種重要方法。在研究小分子配體與G-四鏈體之間相互作用時(shí)，通?？梢允褂脙深愑?jì)算機(jī)分子模擬方法，即分子對接和分子動(dòng)力學(xué)模擬[21]。分子對接是按照幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)以及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則來找到受體與配體之間的最佳結(jié)合模式。分子動(dòng)力學(xué)是按照分子瞬時(shí)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，把相互作用的兩個(gè)體系作為一個(gè)復(fù)合體系，模擬體系之間的非鍵相互作用和體系內(nèi)部各個(gè)構(gòu)象變化。Wei-Bin Wu等[22]利用分子模擬研究表明，化合物以表面堆垛的模式與G-四鏈體作用，側(cè)鏈伸入溝槽穩(wěn)定四鏈體結(jié)構(gòu)，且含有兩條側(cè)鏈的化合物與G-四鏈體的結(jié)合能力更強(qiáng)。

圖6 化合物與G-四鏈體相互作用的分子模擬

4 結(jié)語

本文綜述了研究G-四鏈體結(jié)構(gòu)、小分子誘導(dǎo)并穩(wěn)定G-四鏈體的能力、小分子與G-四鏈體作用模式的技術(shù)手段，為設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案研究小分子和G-四鏈體的作用，以及篩選靶向G-四鏈體的小分子提供了必要的技術(shù)支撐及有價(jià)值的參考。

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