蘇 凱， 桑維鈞＊， 張新強(qiáng)， 潘滴滴， 王 慧

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550000；2.甘肅省天水市秦州縣林業(yè)局，天水 741000；3.貴州省鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣農(nóng)業(yè)局，鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557700）

煙草黑脛病是由煙草疫霉煙草變種（Phytophthoranicotianaevar.nicotianae）引起的毀滅性病害，是世界煙草生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害。該病在我國(guó)各煙草產(chǎn)區(qū)大量發(fā)生，是僅次于煙草病毒病的病害，嚴(yán)重影響了煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病害通常在潮濕、多雨條件下發(fā)病重，潛育期短，再次侵染次數(shù)多，傳播與蔓延迅速，嚴(yán)重時(shí)煙株常成片死亡。目前，防治煙草黑脛病主要通過采用抗病品種、栽培防治、化學(xué)防治等措施，其中化學(xué)防治是最普遍且實(shí)用的方法，但是病菌極易對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性。

烯酰嗎啉是防治疫霉屬病害的高效內(nèi)吸性殺菌劑，其作用為保護(hù)、治療和抑制孢子產(chǎn)生［1］，對(duì)農(nóng)作物上產(chǎn)生的霜霉病、疫霉病有很好的防治作用，其防治范圍為馬鈴薯、番茄晚疫病，黃瓜、油菜霜霉病和辣椒疫病，煙草黑脛病等由鞭毛菌亞門卵菌綱引起的病害。該藥對(duì)卵菌綱的作用特點(diǎn)是首先影響細(xì)胞壁分子結(jié)構(gòu)的重新排列，然后干擾病原菌細(xì)胞壁聚合體的組裝，從而干擾細(xì)胞壁的形成和促使孢子囊壁的分解，使病原菌出現(xiàn)自動(dòng)死亡［2］，因此分析研究對(duì)貴州省煙草黑脛病病菌烯酰嗎啉的敏感性，明確貴州省各煙草產(chǎn)區(qū)抗藥菌的分布和抗藥性水平，為煙草黑脛病的防治提供科學(xué)依據(jù)具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

將貴州省境內(nèi)各煙區(qū)采集的新鮮煙草黑脛病標(biāo)本用自來水沖洗干凈，晾干，剖開莖基部發(fā)病部位，取病健交界處的病組織切成2 mm×2 mm左右大小，沿培養(yǎng)皿周緣直接置于含抗菌素的V8汁選擇性培養(yǎng)基表面，每皿（直徑9 cm）6～10塊。在28℃下培養(yǎng)3～7 d，待菌落形成后，進(jìn)行鏡檢，選擇菌絲無隔膜的繼續(xù)培養(yǎng)，待產(chǎn)生孢子囊后，鏡檢觀察，鑒定。然后再?gòu)木溥吘壡腥? mm×2 mm的菌絲塊轉(zhuǎn)移至盛有V8培養(yǎng)基的試管斜面上，25℃黑暗培養(yǎng)7 d后，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

按照鄭小波的方法［3］，將產(chǎn)生有大量孢子囊的菌絲或菌絲塊挑入盛有10 mL左右滅菌自來水的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿置于4～10℃冰箱中10 min左右后，取出置于適溫（20～25℃）下20 min，在顯微鏡下可以看到有大量游動(dòng)孢子釋放。在冷卻凝固的0.2%V8培養(yǎng)基平板上（培養(yǎng)皿直徑9 cm）滴加游動(dòng)孢子懸浮液100～200μL，約含游動(dòng)孢子200～500個(gè)，均勻涂布于培養(yǎng)基平板表面。培養(yǎng)皿置于室溫下（25℃左右）、黑暗中培養(yǎng)24 h左右，使游動(dòng)孢子休止萌發(fā)，并在培養(yǎng)基上形成微小菌落。并在顯微鏡下觀察；然后在顯微鏡下用滅菌刀片切取帶有單個(gè)已萌發(fā)游動(dòng)孢子的瓊脂塊于選擇性培養(yǎng)基平板上，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)2～3 d后可獲得單游動(dòng)孢子的無性系。

1.2 煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉的敏感性測(cè)定

供試烯酰嗎啉由江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)，有效成分為50%水分散粒劑；先用無菌水配成濃度為10 mg／m L的母液備用。

將黑脛病菌接種于V8培養(yǎng)基上，25℃下黑暗培養(yǎng)5 d后，用直徑5 mm的滅菌打孔器在近菌落邊緣處打孔。取適量已配好的烯酰嗎啉母液，加入融化后即將凝固的V8培養(yǎng)基中，混勻，分別配制成濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0μg／m L V8培養(yǎng)基平板。待培養(yǎng)基冷凝后用接種針挑取菌碟，菌面向下接于含烯酰嗎啉的培養(yǎng)基中心，每皿1塊。接種后放入恒溫箱中，每處理4皿，試驗(yàn)重復(fù)3次，25℃下培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

按下式計(jì)算不同濃度藥劑對(duì)黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率：

計(jì)算抑制率幾率值和濃度對(duì)數(shù)值并建立毒力回歸方程，計(jì)算烯酰嗎啉對(duì)黑脛病菌各菌株的抑制中濃度EC50及相關(guān)系數(shù)R［4］。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（武漢市蔬菜科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所）。對(duì)42個(gè)菌株的EC50用SPSS程序進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，是否符合正態(tài)分布。根據(jù)王文橋等［5］的方法將菌株分為抗性菌株（EC50＞10μg／m L）、中間型菌株（0.1μg／m L≤EC50≤10μg／m L）和敏感菌株（EC50＜0.1μg／m L）。

1.3 煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子囊形成對(duì)烯酰嗎啉的敏感性測(cè)定

參照Matheron等［6］的方法，從生長(zhǎng)在V8平板上的黑脛病菌落邊緣處打直徑為5 mm的菌碟4塊，然后分別置于含有0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μg／mL烯酰嗎啉的9 cm培養(yǎng)皿中（加入藥液時(shí)要使液面剛剛沒過菌碟塊），25℃下光暗交替培養(yǎng)4 d后倒去無菌水，在菌碟上滴加少量酸性品紅，1 min之后從菌碟的一側(cè)慢慢滴加乳酸直至洗去大量品紅［7］。在顯微鏡下可以看到游動(dòng)孢子囊呈現(xiàn)紅色，在菌碟上隨機(jī)選取3個(gè)視野，在顯微鏡下對(duì)游動(dòng)孢子囊進(jìn)行計(jì)數(shù)（包括少量未被染紅的游動(dòng)孢子已出來的孢子囊），每處理3皿，重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理方法同菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)，計(jì)算菌株的EC50并進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草黑脛病菌的分離

從貴州省興仁市屯腳鎮(zhèn)、雨樟鎮(zhèn)，興義烏沙鎮(zhèn)、白碗窯，晴隆縣光照鎮(zhèn)，開陽縣羊場(chǎng)鎮(zhèn)，福泉市黎山鄉(xiāng)，余慶縣松煙鎮(zhèn)、熬溪鎮(zhèn)，湄潭縣抄樂鄉(xiāng)、興隆鎮(zhèn)，遵義縣三岔鎮(zhèn)，銅仁市，大方縣雙山鎮(zhèn)，納雍縣，長(zhǎng)順縣，安龍縣，水城縣，黔西縣林泉鎮(zhèn)，畢節(jié)市等煙草黑脛病經(jīng)常發(fā)生地區(qū)采集發(fā)病樣本，經(jīng)分離、純化和鑒定后，總共得到47個(gè)煙草黑脛病菌菌株。

2.2 煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性水平

2.2.1 煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉的敏感性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定單孢分離得到的47個(gè)單孢菌株的EC50，結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株屬于中間型菌株，煙草黑脛病菌自然種群對(duì)烯酰嗎啉沒有明顯的抗藥性。

在黑脛病菌對(duì)藥劑的敏感性變化范圍內(nèi)，將EC50等分為8個(gè)階段，統(tǒng)計(jì)出每個(gè)階段菌株的個(gè)數(shù)和頻率，然后以每個(gè)階段EC50的中值為橫坐標(biāo)，頻率為縱坐標(biāo)，作出頻率分布圖（圖1），圖中的峰代表病原菌群體對(duì)藥劑的敏感性分布，發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病菌絲對(duì)烯酰嗎啉的敏感性呈單峰曲線，采用SPSS敏感性分布進(jìn)行了K－S正態(tài)性檢驗(yàn)，得到Z＝0.784，P＝0.571，表現(xiàn)連續(xù)性，則表明47個(gè)煙草黑脛病菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性的頻率分布符合正態(tài)分布。

表1 煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉的敏感性（貴州，2011年）Table 1 Sensitivity of mycelial growth of Phytophthora nicotianae var.nicotianae to dimethomorph（Guizhou，2011）

圖1 煙草疫霉病菌47個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉敏感性的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of sensitivity of 47 P.nicotianae var.nicotianae isolates to dimethomorph

2.2.2 不同地區(qū)煙草黑脛病菌菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性差異

采用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)了烯酰嗎啉對(duì)47個(gè)不同地區(qū)菌株EC50值的差異顯著性。結(jié)果顯示：47個(gè)菌株之間EC50值有極顯著性差異（見表2）。EC50最高為興仁屯腳的TJ1菌株，為4.232 7μg／mL，而開陽的KY2菌株EC50最低，只有0.792 6μg／mL，最高值與最低值相差5.34倍，供試47個(gè)菌株的平均EC50為2.476 8μg／m L（見表1）。表明貴州不同地區(qū)的黑脛病菌菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性不同。當(dāng)烯酰嗎啉的濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0μg／m L時(shí)，對(duì)耐藥性最強(qiáng)菌株TJ1的抑制率分別為9.28%、21.20%、36.72%、46.00%，而對(duì)最敏感菌株 KY2的抑制率分別為：47.40%、51.39%、53.65%、60.59%，差異顯著。

表2 烯酰嗎啉對(duì)不同地區(qū)煙草黑脛病菌菌株EC50值的比較1）Table 2 The EC50 values of dimethomorph to different isolates of P.nicotianae var.nicotianae

2.2.3 不同地理來源菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析

烯酰嗎啉對(duì)47個(gè)供試菌株EC50值的離差平方和系統(tǒng)聚類分析結(jié)果（圖2）表明：47個(gè)菌株的EC50值可分為由低到高的4個(gè)聚類組，第1組包括11個(gè)菌株（林泉2個(gè)，烏沙2個(gè)，屯腳3個(gè)，興隆2個(gè)，遵義三岔1個(gè)）；第2組包括3個(gè)菌株（開陽2個(gè)，抄樂的1個(gè)）；第3組包括10個(gè)菌株（水城2個(gè)，長(zhǎng)順1個(gè)，遵義三岔1個(gè)，大方雙山1個(gè)，屯腳2個(gè)，白碗窯1個(gè)，松煙1個(gè)，雨樟1個(gè)）；第4組包括23個(gè)菌株（雨樟1個(gè)，安龍2個(gè)，大方雙山2個(gè)，福泉3個(gè)，畢節(jié)1個(gè)，白碗窯3個(gè)，松煙3個(gè)，晴隆2個(gè)，長(zhǎng)順2個(gè)，光照2個(gè)，抄樂1個(gè)）。大部分菌株出現(xiàn)在第3、4聚類組中，只有少部分菌株單獨(dú)成一類，表明菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性和其地理來源有一定的相關(guān)性，從各系列菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性的變化程度看，福泉、大方雙山最大，林泉、開陽、屯腳、烏沙、興隆的變化幅度最小，與Duncan新復(fù)極差法的分析結(jié)果一致［8］。

2.2.4 煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子囊形成對(duì)烯酰嗎啉的敏感性

烯酰嗎啉對(duì)47個(gè)煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子囊形成的EC50為0.394 5～4.625 3μg／m L（表3），平均EC50為2.040 0μg／m L。不同濃度的烯酰嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌孢子囊形成的影響表明：當(dāng)烯酰嗎啉濃度較低時(shí)，對(duì)不同菌株的產(chǎn)孢抑制率差異明顯，如當(dāng)烯酰嗎啉濃度為0.5μg／m L時(shí)對(duì)菌株BWY3的抑制率為26.3%，而對(duì)菌株FQ4的抑制率則為40.4%。隨著烯酰嗎啉濃度的提高，菌株之間對(duì)烯酰嗎啉的敏感性差異縮小。當(dāng)烯酰嗎啉濃度為8μg／m L時(shí)，其對(duì)煙草黑脛病菌的產(chǎn)孢抑制率已達(dá)100%，表明其可以完全抑制孢子囊的形成，隨著處理濃度的提高，其抑制率差異逐漸縮小，結(jié)果見表3。

圖2 不同地理來源菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析Fig.2 Systemic cluster analyses of sensitivity level of isolates with different geographical origin to dimethomorph

采用SPSS敏感性分布進(jìn)行了K－S正態(tài)性檢驗(yàn)，得Z＝1.127，P＝0.076，同樣表明游動(dòng)孢子囊對(duì)烯酰嗎啉的敏感性呈現(xiàn)出正態(tài)分布，結(jié)果表明烯酰嗎啉對(duì)黑脛病菌的游動(dòng)孢子囊有抑制作用，比對(duì)黑脛病菌菌絲的活性低或大致相等，但也出現(xiàn)了值相反的情況，其中BWY3、FQ1、KY1、QL1和全部的CL系列對(duì)游動(dòng)孢子的EC50值明顯大于對(duì)菌絲的，初步判斷煙草黑脛病菌部分菌株的游動(dòng)孢子已在低濃度下產(chǎn)生了耐藥性。

表3 煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子囊形成對(duì)烯酰嗎啉的敏感性（貴州，2011年）Table 3 Sensitivity of zoosporangia formation of P.nicotianae var.nicotianae to dimethomorph（Guizhou，2011）

圖3 煙草黑脛病菌47個(gè)菌株游動(dòng)孢子囊形成對(duì)烯酰嗎啉敏感性的頻率分布Fig.3 Sensitivity frequency distribution of zoosporangia formation of 47 P.nicotianae var.nicotianae isolates to dimethomorph

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明：絕大部分菌株為烯酰嗎啉一般耐藥型，表明貴州煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉已產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，推測(cè)有2種可能：一種是該地區(qū)煙田間存在天然的耐藥性菌株；另一種是由于煙農(nóng)單一使用烯酰嗎啉，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生適應(yīng)性變異而出現(xiàn)了耐藥性群體。烯酰嗎啉作為生產(chǎn)上單一使用防治煙草黑脛病的藥劑具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，建議采用新型殺菌劑，同時(shí)開展其他殺菌劑的敏感性試驗(yàn)，為減少病菌抗藥性的產(chǎn)生提供理論依據(jù)。

對(duì)來自貴州省主要煙區(qū)47個(gè)菌株抗性的差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果及菌株的抗性系統(tǒng)聚類分析結(jié)果均表明，不同地區(qū)的煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉敏感性存在顯著差異。

煙草黑脛病發(fā)病初期病部在高濕條件下可形成大量游動(dòng)孢子囊并釋放游動(dòng)孢子，所以在田間易形成發(fā)病中心。游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子都可成為再侵染源侵染健康煙株。試驗(yàn)結(jié)果表明，烯酰嗎啉對(duì)黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果與對(duì)游動(dòng)孢子囊的抑制效果基本相同或略好，當(dāng)烯酰嗎啉的濃度達(dá)到8.0μg／mL時(shí)可以完全控制煙草黑脛病菌孢子囊的形成。因此，發(fā)病初期，在田間使用8.0μg／m L以上濃度的烯酰嗎啉可及時(shí)對(duì)游動(dòng)孢子囊及游動(dòng)孢子的萌發(fā)起抑制作用，進(jìn)而有效地抑制病原菌的再侵染，并對(duì)病害的傳播和流行起到較好的控制作用。

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