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        貴州省煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性

        2013-09-28 01:33:52桑維鈞張新強(qiáng)潘滴滴
        植物保護(hù) 2013年1期
        關(guān)鍵詞:孢子囊嗎啉游動(dòng)

        蘇 凱, 桑維鈞*, 張新強(qiáng), 潘滴滴, 王 慧

        (1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550000;2.甘肅省天水市秦州縣林業(yè)局,天水 741000;3.貴州省鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣農(nóng)業(yè)局,鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557700)

        煙草黑脛病是由煙草疫霉煙草變種(Phytophthoranicotianaevar.nicotianae)引起的毀滅性病害,是世界煙草生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害。該病在我國(guó)各煙草產(chǎn)區(qū)大量發(fā)生,是僅次于煙草病毒病的病害,嚴(yán)重影響了煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病害通常在潮濕、多雨條件下發(fā)病重,潛育期短,再次侵染次數(shù)多,傳播與蔓延迅速,嚴(yán)重時(shí)煙株常成片死亡。目前,防治煙草黑脛病主要通過(guò)采用抗病品種、栽培防治、化學(xué)防治等措施,其中化學(xué)防治是最普遍且實(shí)用的方法,但是病菌極易對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗性。

        烯酰嗎啉是防治疫霉屬病害的高效內(nèi)吸性殺菌劑,其作用為保護(hù)、治療和抑制孢子產(chǎn)生[1],對(duì)農(nóng)作物上產(chǎn)生的霜霉病、疫霉病有很好的防治作用,其防治范圍為馬鈴薯、番茄晚疫病,黃瓜、油菜霜霉病和辣椒疫病,煙草黑脛病等由鞭毛菌亞門卵菌綱引起的病害。該藥對(duì)卵菌綱的作用特點(diǎn)是首先影響細(xì)胞壁分子結(jié)構(gòu)的重新排列,然后干擾病原菌細(xì)胞壁聚合體的組裝,從而干擾細(xì)胞壁的形成和促使孢子囊壁的分解,使病原菌出現(xiàn)自動(dòng)死亡[2],因此分析研究對(duì)貴州省煙草黑脛病病菌烯酰嗎啉的敏感性,明確貴州省各煙草產(chǎn)區(qū)抗藥菌的分布和抗藥性水平,為煙草黑脛病的防治提供科學(xué)依據(jù)具有重要的實(shí)踐意義。

        1 材料與方法

        1.1 病原菌的分離與純化

        將貴州省境內(nèi)各煙區(qū)采集的新鮮煙草黑脛病標(biāo)本用自來(lái)水沖洗干凈,晾干,剖開(kāi)莖基部發(fā)病部位,取病健交界處的病組織切成2 mm×2 mm左右大小,沿培養(yǎng)皿周緣直接置于含抗菌素的V8汁選擇性培養(yǎng)基表面,每皿(直徑9 cm)6~10塊。在28℃下培養(yǎng)3~7 d,待菌落形成后,進(jìn)行鏡檢,選擇菌絲無(wú)隔膜的繼續(xù)培養(yǎng),待產(chǎn)生孢子囊后,鏡檢觀察,鑒定。然后再?gòu)木溥吘壡腥? mm×2 mm的菌絲塊轉(zhuǎn)移至盛有V8培養(yǎng)基的試管斜面上,25℃黑暗培養(yǎng)7 d后,常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

        按照鄭小波的方法[3],將產(chǎn)生有大量孢子囊的菌絲或菌絲塊挑入盛有10 mL左右滅菌自來(lái)水的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿置于4~10℃冰箱中10 min左右后,取出置于適溫(20~25℃)下20 min,在顯微鏡下可以看到有大量游動(dòng)孢子釋放。在冷卻凝固的0.2%V8培養(yǎng)基平板上(培養(yǎng)皿直徑9 cm)滴加游動(dòng)孢子懸浮液100~200μL,約含游動(dòng)孢子200~500個(gè),均勻涂布于培養(yǎng)基平板表面。培養(yǎng)皿置于室溫下(25℃左右)、黑暗中培養(yǎng)24 h左右,使游動(dòng)孢子休止萌發(fā),并在培養(yǎng)基上形成微小菌落。并在顯微鏡下觀察;然后在顯微鏡下用滅菌刀片切取帶有單個(gè)已萌發(fā)游動(dòng)孢子的瓊脂塊于選擇性培養(yǎng)基平板上,在25℃黑暗條件下培養(yǎng)2~3 d后可獲得單游動(dòng)孢子的無(wú)性系。

        1.2 煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉的敏感性測(cè)定

        供試烯酰嗎啉由江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn),有效成分為50%水分散粒劑;先用無(wú)菌水配成濃度為10 mg/m L的母液備用。

        將黑脛病菌接種于V8培養(yǎng)基上,25℃下黑暗培養(yǎng)5 d后,用直徑5 mm的滅菌打孔器在近菌落邊緣處打孔。取適量已配好的烯酰嗎啉母液,加入融化后即將凝固的V8培養(yǎng)基中,混勻,分別配制成濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0μg/m L V8培養(yǎng)基平板。待培養(yǎng)基冷凝后用接種針挑取菌碟,菌面向下接于含烯酰嗎啉的培養(yǎng)基中心,每皿1塊。接種后放入恒溫箱中,每處理4皿,試驗(yàn)重復(fù)3次,25℃下培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

        按下式計(jì)算不同濃度藥劑對(duì)黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率:

        計(jì)算抑制率幾率值和濃度對(duì)數(shù)值并建立毒力回歸方程,計(jì)算烯酰嗎啉對(duì)黑脛病菌各菌株的抑制中濃度EC50及相關(guān)系數(shù)R[4]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(武漢市蔬菜科學(xué)研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所)。對(duì)42個(gè)菌株的EC50用SPSS程序進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),是否符合正態(tài)分布。根據(jù)王文橋等[5]的方法將菌株分為抗性菌株(EC50>10μg/m L)、中間型菌株(0.1μg/m L≤EC50≤10μg/m L)和敏感菌株(EC50<0.1μg/m L)。

        1.3 煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子囊形成對(duì)烯酰嗎啉的敏感性測(cè)定

        參照Matheron等[6]的方法,從生長(zhǎng)在V8平板上的黑脛病菌落邊緣處打直徑為5 mm的菌碟4塊,然后分別置于含有0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μg/mL烯酰嗎啉的9 cm培養(yǎng)皿中(加入藥液時(shí)要使液面剛剛沒(méi)過(guò)菌碟塊),25℃下光暗交替培養(yǎng)4 d后倒去無(wú)菌水,在菌碟上滴加少量酸性品紅,1 min之后從菌碟的一側(cè)慢慢滴加乳酸直至洗去大量品紅[7]。在顯微鏡下可以看到游動(dòng)孢子囊呈現(xiàn)紅色,在菌碟上隨機(jī)選取3個(gè)視野,在顯微鏡下對(duì)游動(dòng)孢子囊進(jìn)行計(jì)數(shù)(包括少量未被染紅的游動(dòng)孢子已出來(lái)的孢子囊),每處理3皿,重復(fù)3次,數(shù)據(jù)處理方法同菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn),計(jì)算菌株的EC50并進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 煙草黑脛病菌的分離

        從貴州省興仁市屯腳鎮(zhèn)、雨樟鎮(zhèn),興義烏沙鎮(zhèn)、白碗窯,晴隆縣光照鎮(zhèn),開(kāi)陽(yáng)縣羊場(chǎng)鎮(zhèn),福泉市黎山鄉(xiāng),余慶縣松煙鎮(zhèn)、熬溪鎮(zhèn),湄潭縣抄樂(lè)鄉(xiāng)、興隆鎮(zhèn),遵義縣三岔鎮(zhèn),銅仁市,大方縣雙山鎮(zhèn),納雍縣,長(zhǎng)順縣,安龍縣,水城縣,黔西縣林泉鎮(zhèn),畢節(jié)市等煙草黑脛病經(jīng)常發(fā)生地區(qū)采集發(fā)病樣本,經(jīng)分離、純化和鑒定后,總共得到47個(gè)煙草黑脛病菌菌株。

        2.2 煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉的敏感性水平

        2.2.1 煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉的敏感性

        采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定單孢分離得到的47個(gè)單孢菌株的EC50,結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株屬于中間型菌株,煙草黑脛病菌自然種群對(duì)烯酰嗎啉沒(méi)有明顯的抗藥性。

        在黑脛病菌對(duì)藥劑的敏感性變化范圍內(nèi),將EC50等分為8個(gè)階段,統(tǒng)計(jì)出每個(gè)階段菌株的個(gè)數(shù)和頻率,然后以每個(gè)階段EC50的中值為橫坐標(biāo),頻率為縱坐標(biāo),作出頻率分布圖(圖1),圖中的峰代表病原菌群體對(duì)藥劑的敏感性分布,發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病菌絲對(duì)烯酰嗎啉的敏感性呈單峰曲線,采用SPSS敏感性分布進(jìn)行了K-S正態(tài)性檢驗(yàn),得到Z=0.784,P=0.571,表現(xiàn)連續(xù)性,則表明47個(gè)煙草黑脛病菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性的頻率分布符合正態(tài)分布。

        表1 煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉的敏感性(貴州,2011年)Table 1 Sensitivity of mycelial growth of Phytophthora nicotianae var.nicotianae to dimethomorph(Guizhou,2011)

        圖1 煙草疫霉病菌47個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)對(duì)烯酰嗎啉敏感性的頻率分布Fig.1 Frequency distribution of sensitivity of 47 P.nicotianae var.nicotianae isolates to dimethomorph

        2.2.2 不同地區(qū)煙草黑脛病菌菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性差異

        采用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)了烯酰嗎啉對(duì)47個(gè)不同地區(qū)菌株EC50值的差異顯著性。結(jié)果顯示:47個(gè)菌株之間EC50值有極顯著性差異(見(jiàn)表2)。EC50最高為興仁屯腳的TJ1菌株,為4.232 7μg/mL,而開(kāi)陽(yáng)的KY2菌株EC50最低,只有0.792 6μg/mL,最高值與最低值相差5.34倍,供試47個(gè)菌株的平均EC50為2.476 8μg/m L(見(jiàn)表1)。表明貴州不同地區(qū)的黑脛病菌菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性不同。當(dāng)烯酰嗎啉的濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0μg/m L時(shí),對(duì)耐藥性最強(qiáng)菌株TJ1的抑制率分別為9.28%、21.20%、36.72%、46.00%,而對(duì)最敏感菌株 KY2的抑制率分別為:47.40%、51.39%、53.65%、60.59%,差異顯著。

        表2 烯酰嗎啉對(duì)不同地區(qū)煙草黑脛病菌菌株EC50值的比較1)Table 2 The EC50 values of dimethomorph to different isolates of P.nicotianae var.nicotianae

        2.2.3 不同地理來(lái)源菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析

        烯酰嗎啉對(duì)47個(gè)供試菌株EC50值的離差平方和系統(tǒng)聚類分析結(jié)果(圖2)表明:47個(gè)菌株的EC50值可分為由低到高的4個(gè)聚類組,第1組包括11個(gè)菌株(林泉2個(gè),烏沙2個(gè),屯腳3個(gè),興隆2個(gè),遵義三岔1個(gè));第2組包括3個(gè)菌株(開(kāi)陽(yáng)2個(gè),抄樂(lè)的1個(gè));第3組包括10個(gè)菌株(水城2個(gè),長(zhǎng)順1個(gè),遵義三岔1個(gè),大方雙山1個(gè),屯腳2個(gè),白碗窯1個(gè),松煙1個(gè),雨樟1個(gè));第4組包括23個(gè)菌株(雨樟1個(gè),安龍2個(gè),大方雙山2個(gè),福泉3個(gè),畢節(jié)1個(gè),白碗窯3個(gè),松煙3個(gè),晴隆2個(gè),長(zhǎng)順2個(gè),光照2個(gè),抄樂(lè)1個(gè))。大部分菌株出現(xiàn)在第3、4聚類組中,只有少部分菌株單獨(dú)成一類,表明菌株對(duì)烯酰嗎啉的敏感性和其地理來(lái)源有一定的相關(guān)性,從各系列菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性的變化程度看,福泉、大方雙山最大,林泉、開(kāi)陽(yáng)、屯腳、烏沙、興隆的變化幅度最小,與Duncan新復(fù)極差法的分析結(jié)果一致[8]。

        2.2.4 煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子囊形成對(duì)烯酰嗎啉的敏感性

        烯酰嗎啉對(duì)47個(gè)煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子囊形成的EC50為0.394 5~4.625 3μg/m L(表3),平均EC50為2.040 0μg/m L。不同濃度的烯酰嗎啉對(duì)煙草黑脛病菌孢子囊形成的影響表明:當(dāng)烯酰嗎啉濃度較低時(shí),對(duì)不同菌株的產(chǎn)孢抑制率差異明顯,如當(dāng)烯酰嗎啉濃度為0.5μg/m L時(shí)對(duì)菌株BWY3的抑制率為26.3%,而對(duì)菌株FQ4的抑制率則為40.4%。隨著烯酰嗎啉濃度的提高,菌株之間對(duì)烯酰嗎啉的敏感性差異縮小。當(dāng)烯酰嗎啉濃度為8μg/m L時(shí),其對(duì)煙草黑脛病菌的產(chǎn)孢抑制率已達(dá)100%,表明其可以完全抑制孢子囊的形成,隨著處理濃度的提高,其抑制率差異逐漸縮小,結(jié)果見(jiàn)表3。

        圖2 不同地理來(lái)源菌株對(duì)烯酰嗎啉敏感性水平的系統(tǒng)聚類分析Fig.2 Systemic cluster analyses of sensitivity level of isolates with different geographical origin to dimethomorph

        采用SPSS敏感性分布進(jìn)行了K-S正態(tài)性檢驗(yàn),得Z=1.127,P=0.076,同樣表明游動(dòng)孢子囊對(duì)烯酰嗎啉的敏感性呈現(xiàn)出正態(tài)分布,結(jié)果表明烯酰嗎啉對(duì)黑脛病菌的游動(dòng)孢子囊有抑制作用,比對(duì)黑脛病菌菌絲的活性低或大致相等,但也出現(xiàn)了值相反的情況,其中BWY3、FQ1、KY1、QL1和全部的CL系列對(duì)游動(dòng)孢子的EC50值明顯大于對(duì)菌絲的,初步判斷煙草黑脛病菌部分菌株的游動(dòng)孢子已在低濃度下產(chǎn)生了耐藥性。

        表3 煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子囊形成對(duì)烯酰嗎啉的敏感性(貴州,2011年)Table 3 Sensitivity of zoosporangia formation of P.nicotianae var.nicotianae to dimethomorph(Guizhou,2011)

        圖3 煙草黑脛病菌47個(gè)菌株游動(dòng)孢子囊形成對(duì)烯酰嗎啉敏感性的頻率分布Fig.3 Sensitivity frequency distribution of zoosporangia formation of 47 P.nicotianae var.nicotianae isolates to dimethomorph

        3 結(jié)論與討論

        試驗(yàn)結(jié)果表明:絕大部分菌株為烯酰嗎啉一般耐藥型,表明貴州煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉已產(chǎn)生了不同程度的耐藥性,推測(cè)有2種可能:一種是該地區(qū)煙田間存在天然的耐藥性菌株;另一種是由于煙農(nóng)單一使用烯酰嗎啉,導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生適應(yīng)性變異而出現(xiàn)了耐藥性群體。烯酰嗎啉作為生產(chǎn)上單一使用防治煙草黑脛病的藥劑具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性,建議采用新型殺菌劑,同時(shí)開(kāi)展其他殺菌劑的敏感性試驗(yàn),為減少病菌抗藥性的產(chǎn)生提供理論依據(jù)。

        對(duì)來(lái)自貴州省主要煙區(qū)47個(gè)菌株抗性的差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果及菌株的抗性系統(tǒng)聚類分析結(jié)果均表明,不同地區(qū)的煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉敏感性存在顯著差異。

        煙草黑脛病發(fā)病初期病部在高濕條件下可形成大量游動(dòng)孢子囊并釋放游動(dòng)孢子,所以在田間易形成發(fā)病中心。游動(dòng)孢子囊和游動(dòng)孢子都可成為再侵染源侵染健康煙株。試驗(yàn)結(jié)果表明,烯酰嗎啉對(duì)黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果與對(duì)游動(dòng)孢子囊的抑制效果基本相同或略好,當(dāng)烯酰嗎啉的濃度達(dá)到8.0μg/mL時(shí)可以完全控制煙草黑脛病菌孢子囊的形成。因此,發(fā)病初期,在田間使用8.0μg/m L以上濃度的烯酰嗎啉可及時(shí)對(duì)游動(dòng)孢子囊及游動(dòng)孢子的萌發(fā)起抑制作用,進(jìn)而有效地抑制病原菌的再侵染,并對(duì)病害的傳播和流行起到較好的控制作用。

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