蔡吉林， 束長龍， 宋福平， 黃 勃， 張 杰＊

（1.安徽省微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

小菜蛾［Plutella xylostella （Linnaeus）］，屬鱗翅目，菜蛾科，是一種世界性的十字花科蔬菜害蟲［1］。它是首個(gè)在田間對Bt制劑產(chǎn)生抗性的害蟲［2］。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種在自然界廣泛分布的革蘭氏陽性細(xì)菌，其主要特征是在芽胞形成的同時(shí)產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等多種昆蟲具有特異殺蟲活性［3－6］。由于Bt對人畜無害，環(huán)境友好，在小菜蛾等重要農(nóng)業(yè)害蟲防治中扮演了重要的角色，它是目前世界上開發(fā)時(shí)間最長、應(yīng)用最成功的微生物殺蟲劑。截止到2012年4月，Bt國際命名委員會網(wǎng)站上已公布的Cry類殺蟲晶體蛋白有624種，其中Cry1類蛋白244種，Cry9類蛋白30種。

單價(jià)cry基因在應(yīng)用過程中遇到了一些問題，例如毒力有限、殺蟲譜窄、害蟲易產(chǎn)生抗性等問題。1985年，Wu和Chang第一個(gè)證實(shí)了Bt以色列亞種（B.thuringiensis subsp.israelensis，Bti）中26ku和65ku蛋白組合有增效作用，26ku和130ku蛋白組合也表現(xiàn)出了相似的作用［7］。隨后其他Cry蛋白間的協(xié)同作用陸續(xù)報(bào)道。張杰等發(fā)現(xiàn)Cry1Ba和Cry3Aa基因組合對鞘翅目葉甲科害蟲具有高毒力［8］；薛 建 麗 對 甜 菜 夜 蛾 ［Spodoptera exigua（Hübner）］增效研究發(fā)現(xiàn)Cry1C和Cry1Aa等比混配時(shí)增效因子達(dá)到4.0［9］；Sharma發(fā)現(xiàn) Cry1Ab和Cry1Ac組合對斑禾草螟［Chilo partellus（Swinhoe）］有 3 倍 左 右 的 增 效 作 用［10］；Peng 等 發(fā) 現(xiàn)Cry6Aa和Cry55Aa等比混配對南方根結(jié)線蟲［Meloidogyne incognita （Kofoid et White）］增效可達(dá)5倍［11］。但是目前關(guān)于Cry蛋白對小菜蛾的增效研究很少，只有劉楠發(fā)現(xiàn)Cry1Ba與Cry1Ia組合對小菜蛾有相加作用的報(bào)道［12］。因此，尋找與篩選對小菜蛾高效的蛋白組合對于此類害蟲防治具有重要的意義。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所先后克隆了cry1Ai2＊、cry1Ea8＊、cry9Aa3 基因［13］。研究發(fā)現(xiàn)Cry1Ai和Cry1Ea蛋白均對小菜蛾等鱗翅目害蟲具有高毒力（專利申請?zhí)枺?00910241558），Cry9Aa蛋白不僅對敏感種群小菜蛾和亞洲玉米螟［Ostrinia furnacalis（Guenée）］具有很強(qiáng)的毒殺作用，而且對Cry1Ac蛋白抗性小菜蛾也無交互抗性［13］。

本研究以Cry1Ai、Cry1Ea和Cry9Aa蛋白為材料，在單獨(dú)測定各種蛋白殺蟲活性的基礎(chǔ)上，把Cry1Ai＋ Cry1Ea、Cry1Ea＋ Cry9Aa、Cry1Ai＋Cry9Aa蛋白進(jìn)行不同比例的混配，篩選到了對小菜蛾具有顯著增效作用的蛋白組合。這些結(jié)果將為工程菌的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的培育提供優(yōu)良的殺蟲基因組合。

1 材料與方法

1.1 菌株特征及來源

所用菌株均為本組保藏，Rosetta－1Ai、Rosetta－1Ea和Rosetta－9Aa［13］分別為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有cry1Ai、cry1Ea、cry9Aa基因大腸桿菌表達(dá)菌株，詳見表1。

表1 菌株及其表達(dá)的Cry蛋白特性Table 1 Strains and properties of their expressed Cry proteins

1.2 試劑和設(shè)備

1.2.1 試劑

液體 LB培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨（tryptone），0.5%酵母提取物（yeast extract），1.0%氯化鈉，pH 7.0，121 ℃／20min滅菌；抗生素：氨芐青霉素100mg／mL，氯霉素 34mg／mL，－20 ℃ 保存；IPTG：IPTG 水溶液1mol／L，－20 ℃保存；Tris－HCl：1mol／L（pH 8.0）121℃／20min滅菌后室溫保存；SI：50%乙醇，10%乙酸，40%去離子水；SII：7.5%乙酸，5%乙醇，87.5%去離子水；SIII：0.25%的考馬斯亮藍(lán)R250乙醇溶液；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純化學(xué)試劑。

1.2.2 儀器設(shè)備

搖床：D250，美國NBS公司；落地式高速冷凍離心機(jī)：Avanti J－26XP，美國Beckman Coulter公司；蛋白電泳儀：Mini protein III美國Bio－Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)：Universal HoodⅡ，美國Bio－Rad公司；超聲波破碎儀：CP 750，寧波新芝生物公司。

1.3 供試?yán)ハx

敏感種群小菜蛾，2000年采自北京海淀區(qū)永豐甘藍(lán)菜地，由本實(shí)驗(yàn)室采用蘿卜苗飼養(yǎng)。室內(nèi)條件下，從卵孵化為幼蟲至化蛹需要14d左右，蛹3～4d后羽化成蟲，1～2d后成蟲交配、產(chǎn)卵；該試蟲一個(gè)生活史大約20d左右。

1.4 Cry蛋白的制備與分析

1.4.1 大腸桿菌培養(yǎng)與Cry蛋白提取

37 ℃ 過 夜 活 化 Rosetta－1Ai、Rosetta－1Ea、Rosetta－9Aa菌株，以1%的接種量轉(zhuǎn)接于液體LB培養(yǎng)基中，37℃，220r／min培養(yǎng)2h使其A600為0.5。加入誘導(dǎo)物IPTG，終濃度為0.5mmol／L。150r／min，20℃誘導(dǎo)10h，4 ℃，8 000r／min離心10min收集菌體。收集菌體加入20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）懸浮，超聲破碎完全后，4℃，12 000r／min離心10min，收集可溶組分，非可溶組分懸浮于20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）緩沖液中。

1.4.2 Cry蛋白SDS－PAGE分析

吸取蛋白溶液10μL，加入30μL ddH2O，加入10μL 5×Loading Buffer，充分混勻。100℃煮沸8min，12 000r／min離心5min，取上清為電泳樣品。SDS－PAGE電泳條件：4%濃縮膠，8%分離膠，80V電泳10min，140V電泳直到溴酚藍(lán)達(dá)到膠底邊緣并溢出電泳槽。電泳結(jié)束后取出凝膠，加入50mL SI加熱30s，60r／min振蕩10min；倒掉SI加入含SIII的SII（每50mL SII加200μL SIII）加熱30s，60r／min振蕩1h。上樣緩沖液、染色脫色液與凝膠配制參照文獻(xiàn)［14］。

1.5 生物活性測定

人工飼料購于美國Southland Products Incorporated公司，配制方法見產(chǎn)品說明。稱取15g人工飼料放置于滅菌培養(yǎng)皿中，加入待測樣品的稀釋液1.5mL（10μg／g向下設(shè)定7個(gè)梯度，2倍梯度稀釋），充分?jǐn)嚢杌靹颍骄盅b于3個(gè)平皿中，每皿接入20頭2齡幼蟲，醫(yī)用膠帶封口，每個(gè)濃度重復(fù)3次。兩種混配的Cry蛋白按照質(zhì)量比混配成不同的蛋白溶 液 進(jìn) 行 生 物測定，20mmol／L 的 Tris－Cl（pH－8.0）緩沖液作為空白對照，48h調(diào)查結(jié)果（L∥D＝16h∥8h，RH：50%）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用National Institutes of Health開發(fā)的imageJ（V1.43）分析SDS－PAGE圖譜并進(jìn)行定量，使用方法參考ImageJ User Guide1.43m。采用SPSS（V13.0）軟件計(jì)算LC50等相關(guān)結(jié)果，協(xié)同毒力指數(shù)采用Tabashnik公式法計(jì)算［15］，公式如下：

協(xié)同毒力指數(shù)＝預(yù)期LC50／實(shí)測LC50。由于試驗(yàn)誤差和供試生物等未被覺察到的不一致性，一般認(rèn)為：預(yù)期LC50與實(shí)測LC50的毒力比在0.5～2.6之間屬相加作用，大于2.6屬增效作用，小于0.5時(shí)屬拮抗作用（Finney法）［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺蟲蛋白SDS－PAGE分析

Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa蛋白 SDS－PAGE 分析結(jié)果見圖1。3種基因均能正常表達(dá)，Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa蛋白的分子量分別為133、133、129ku。利用imageJ定量，濃度分別為2.5、1.0、2.0mg／mL（可溶組分中Cry蛋白含量很低，圖略）。

圖1 3種Cry蛋白的SDS－PAGE定量分析Fig.1 SDS－PAGE quantitative analysis of 3Cry proteins

2.2 小菜蛾生物活性測定

2.2.1 Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa蛋白殺蟲結(jié)果

Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa蛋白對小菜蛾2齡幼蟲48h的LC50分別為1.52、5.47μg／g和3.27μg／g，結(jié)果詳見表2。3種蛋白對靶標(biāo)害蟲均表現(xiàn)出了很高的毒力。

表2 3種Cry蛋白單獨(dú)及其混配（1∶1）對小菜蛾生物活性測定結(jié)果Table 2 Bioassay of 3Cry proteins，alone or mixture（1∶1），against P.xylostella

2.2.2 Cry1Ai＋Cry9Aa和Cry1Ea＋Cry9Aa蛋白混配組合殺蟲結(jié)果

在上述單一蛋白活性測定的基礎(chǔ)上，繼續(xù)測定了這3種蛋白兩兩等比例混合樣品的殺蟲活性，結(jié)果表明Cry1Ai＋Cry9Aa組合LC50＝0.23μg／g，增效因子為9.06，這個(gè)組合有非常顯著的協(xié)同增效作用。Cry1Ea＋Cry9Aa組合LC50＝0.60μg／g，增效因子為6.67，這個(gè)組合有明顯的增效作用。Cry1Ai＋Cry1Ea組合 LC50＝1.65μg／g，增 效 因 子 只 有1.43，說明這個(gè)組合僅有較強(qiáng)的相加作用（結(jié)果詳見表2）。

根據(jù)這些研究結(jié)果，我們針對Cry1Ai＋Cry9Aa和Cry1Ea＋Cry9Aa兩種組合分別設(shè)計(jì)了不同比例的毒素混配對小菜蛾的殺蟲測定。

表3結(jié)果顯示：Cry1Ai＋Cry9Aa蛋白組合1∶1混配時(shí)增效因子為9.06；1∶2混配時(shí)的增效因子為8.21；1∶4混配時(shí)的增效因子為8.71，說明1∶1混配時(shí)增效因子最高。

表3 不同比例的Cry1Ai＋Cry9Aa蛋白組合混配對小菜蛾的生物測定結(jié)果Table 3 Bioassay of the Cry1Ai＋Cry9Aa protein mixture with different proportions against P.xylostella

表4結(jié)果顯示：Cry1Ea＋Cry9Aa蛋白組合1∶1混配時(shí)增效因子為6.67；1∶2混配時(shí)的增效因子為5.92；1∶4混配時(shí)的增效因子為5.76，說明1∶1混配時(shí)增效因子最高。

表4 不同比例的Cry1Ea和Cry9Aa蛋白混配對小菜蛾的生物測定結(jié)果Table 4 Bioassay of the Cry1Ea＋Cry9Aa protein mixture with different proportions against P.xylostella

3 討論

本文在對Cry1Ai、Cry1Ea、Cry9Aa 3種蛋白對小菜蛾2齡幼蟲殺蟲活性測定的基礎(chǔ)上，篩選到對小菜蛾毒殺具有顯著增效的蛋白組合Cry1Ai＋Cry9Aa和Cry1Ea＋Cry9Aa。增效因子分別達(dá)到了9.06和6.67。并且研究了兩種蛋白以不同比例進(jìn)行混配的殺蟲效果，得出的結(jié)論是蛋白進(jìn)行等比混合時(shí)增效最顯著。

目前國內(nèi)關(guān)于Bt對小菜蛾增效的研究很少，2010年劉楠利用Cry1Ba3和Cry1Ia8對小菜蛾增效，結(jié)果顯示兩者只有微弱的相加作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)了對小菜蛾具有顯著增效的蛋白組合，這種組合明顯提高了蛋白的毒力。而蘇慧琴等報(bào)道Cry9A等與Cry1A蛋白無交互抗性［13］，因此本研究獲得的Cry1Ai＋Cry9Aa和Cry1Ea＋Cry9Aa兩種高效組合有望在治理對Cry1A類蛋白產(chǎn)生抗性的害蟲中發(fā)揮重要的作用［17］。這些結(jié)果將為轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的研發(fā)提供新的基因來源，同時(shí)將指導(dǎo)我們繼續(xù)深入發(fā)掘?qū)氋F的Bt基因資源，實(shí)現(xiàn)Bt生防資源的可持續(xù)開發(fā)與利用。

Domain II決定毒素的專一性和與受體的特異性結(jié)合［18］，通過序列比對發(fā)現(xiàn)：Cry1Ai和 Cry9Aa的Domain II相似性為20.4%，Cry1Ea和Cry9Aa的Domain II相似性為22.6%，相似性都較低（比對數(shù)據(jù)來自http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）。推測這兩組蛋白在小菜蛾的BBMV上可能結(jié)合不同的受體進(jìn)而產(chǎn)生協(xié)同增效作用。關(guān)于兩者協(xié)同增效的作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果來驗(yàn)證。

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