劉鑫燕， 高 濤， 王 粲， 吳立偉， 汪 昕， 周 蓉， 余春梅

（南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南通 226019）

小麥葉枯?。╳heat leaf blight and spot）是引起小麥葉斑和葉枯類(lèi)病害的總稱(chēng)，世界上報(bào)道的葉枯病的病原菌達(dá)20多種，而殼針孢葉枯?。⊿eptoria leaf blotch）、小麥鏈格孢葉枯?。ˋlternaria leaf blight）、小麥黃斑葉枯?。╰an spot）等已經(jīng)成為我國(guó)小麥生產(chǎn)的重要病害［1］。小麥感染葉枯病病菌后，常造成葉片早枯，影響籽粒灌漿，造成穗粒數(shù)減少，千粒重下降，有些葉枯病原菌還可引起籽粒的黑胚?。?］，降低小麥產(chǎn)量以及小麥商品糧等級(jí)。

鏈鉻孢屬（Alternaria）中有多種病菌能引起小麥的葉枯病害。20世紀(jì)60年代曾在印度發(fā)生過(guò)鏈格孢屬的A.triticina引起的病害流行，導(dǎo)致大約60%～75%小麥減產(chǎn)。王春江等［3］和商鴻生等［4］的研究認(rèn)為，鏈格孢葉枯病在20世紀(jì)70年代就已經(jīng)在我國(guó)的一些育種苗圃中發(fā)生，并曾在1997－1998年間，在黃河中下游和江淮麥區(qū)有較大面積的發(fā)生。由于高溫高濕條件有利于葉枯病的發(fā)生，我國(guó)黃河中下游、江淮麥區(qū)、長(zhǎng)江流域以及西南麥區(qū)在小麥生育期的中后期通常會(huì)遭遇高溫高濕氣候，為葉枯病的大發(fā)生提供了可能的環(huán)境條件。與小麥常見(jiàn)的赤霉病、白粉病等相比較，該病在我國(guó)的出現(xiàn)相對(duì)較晚且對(duì)該病的認(rèn)識(shí)尚處在起步階段。邢小萍等［5］2005－2007年度對(duì)河南省主栽小麥品種葉枯病田間發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有對(duì)葉枯病免疫的品種。盡管該調(diào)查并未說(shuō)明致病病菌，但至少說(shuō)明了葉枯病的發(fā)生在我國(guó)小麥生產(chǎn)中可能具有普遍性。因此，在發(fā)生葉枯病栽培區(qū)域，鑒定引起葉枯病癥狀的病原菌種類(lèi)，研究小麥中抗病基因的抗性遺傳規(guī)律，鑒定抗病基因資源，并進(jìn)一步應(yīng)用于育種實(shí)踐將具有積極意義。

本試驗(yàn)根據(jù)科赫氏法則，從具有葉枯病癥狀的四倍體野生二粒小麥上分離了致病菌，通過(guò)孢子形態(tài)和核糖體rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）分子進(jìn)化分析對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定。在離體無(wú)菌條件下，對(duì)抗病與感病親本以及其雜交所得的200多個(gè)F2∶3家系進(jìn)行了抗病性鑒定，初步解析了抗病基因的遺傳規(guī)律，為進(jìn)一步通過(guò)分子標(biāo)記定位抗病基因以及開(kāi)展分子標(biāo)記輔助育種奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

四倍體野生二粒小麥（Triticum dicoccoides，2n＝28，AABB）親本‘JIC106003’以及‘JIC106007’引自中國(guó)科學(xué)院遺傳發(fā)育所植物細(xì)胞與染色體國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)室于2008年配置雜交組合，并于2009－2011年分別對(duì)F1、F2單株及F2：3家系進(jìn)行了抗病性鑒定。供試葉枯病病原菌由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 病原菌的分離純化

在試驗(yàn)地取苗期（四葉期）至抽穗期的發(fā)病葉片，剪成5cm左右的小段用75%乙醇浸泡3min，無(wú)菌水沖洗1次，放入1%次氯酸鈉中浸泡30s，無(wú)菌水沖洗3次。吸取100μL最后一次洗滌用水涂布于PSA固體培養(yǎng)基作為無(wú)菌對(duì)照。將表面消毒的葉片，從發(fā)病區(qū)域剪取5mm×5mm大小放PSA固體培養(yǎng)基表面，置于28℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并觀(guān)察。將獲得的真菌進(jìn)行純化后，用透明膠帶法［6］對(duì)分離到的菌絲進(jìn)行制片，并用石炭酸棉蘭染液染色后進(jìn)行鏡檢。

1.3 病原性試驗(yàn)

按李大海等［7］的方法進(jìn)行病原性試驗(yàn)。首先對(duì)健康葉片進(jìn)行表面消毒（同1.2），并在葉片上滴加2滴20μL真菌孢子懸浮液［（4.0～5.0）×103個(gè)／mL］，放置在光照培養(yǎng)箱中（24℃，12h光照）。接菌后的48h內(nèi)葉片基本無(wú)病斑發(fā)展，48h后病斑逐漸發(fā)展，將能在感病親本中發(fā)病的菌株進(jìn)一步培養(yǎng)后用于后續(xù)的分子生物學(xué)鑒定和F2∶3家系抗病性調(diào)查。

1.4 病原菌DNA的提取

用真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶），并按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病原菌基因組DNA的提取。

1.5 病原菌的分子鑒定以及菌落類(lèi)群分析

根據(jù) White等［8］的報(bào)道，用跨5.8rDNA基因兩側(cè) ITS 的 引 物 ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGAT ATGC－3′分 別 與 ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′和 ITS5：5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′配對(duì)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20μL，總體積中加入10ng／μL模板1μL，10×LATaq（大連寶生物）緩沖液2μL，10μmol／L上下游引物各0.2μL，2.5mmol／L的 dNTPs 2μL，適量滅菌雙蒸餾水。95℃變性5min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。并將ITS4與ITS1和ITS5配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收（鼎國(guó)公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒），連接克隆于pMD18－T載體（大連寶生物），陽(yáng)性菌落送上海Invitrogen公司測(cè)序。

在GenBank查找Vergnes等［9］報(bào)道的相關(guān)序列，以E.pedicillatum 作為外類(lèi)群，使用Clustal W2進(jìn)行多序列比對(duì)，MEGA5.0軟件中Neighbor－Joining（NJ）法進(jìn)行建樹(shù)，Bootstrap值設(shè)為500。

1.6 遺傳群體中抗病性調(diào)查及評(píng)價(jià)方法

離體葉鑒定根據(jù)病斑反應(yīng)型和嚴(yán)重度來(lái)確定供試材料的抗性。參照李大海等［7］的方法，進(jìn)行病情調(diào)查和抗性分析。

按以下公式計(jì)算每個(gè)單株的病情發(fā)展曲線(xiàn)下面積（area under the disease progress curve，AUDPC）。AUDPC＝∑［（Xi＋Xi＋1）／2］（ti＋1－ti）。式中的Xi和Xi＋1分別是第i次記載和第i＋1次記載的嚴(yán)重度，ti＋1－ti是第i＋1次記載和第i次記載之間所間隔的時(shí)間。本研究根據(jù)病斑的發(fā)展，從接種72h后開(kāi)始記錄病情，間隔24h，連續(xù)記錄3次。

1.7 抗病基因遺傳特性的鑒定

根據(jù)親本、F1、F2單株田間自然發(fā)病情況以及F2：3家系實(shí)驗(yàn)室接種病情統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用質(zhì)量性狀的分離規(guī)律和適合度（χ2）檢測(cè)抗病基因數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生二粒小麥葉枯病表型

根據(jù)2007－2009年親本的抗病表型，抗病野生二粒小麥在自然條件下葉片無(wú)病斑（圖1a），感病野生二粒小麥葉片出現(xiàn)橢圓形的褪綠小斑，后病斑連接成片，中間有黑色至褐灰色，邊緣黃色。感病材料的葉片從基部直至倒二葉均有不同程度的病斑，第2片葉基本壞死，第3葉有較大面積的病斑，上部4～6葉病斑較輕（圖1b）。根據(jù)龍宗權(quán)［1］、商鴻生等［3］的研究，初步判斷是由鏈格孢葉枯病病菌引起的病害。根據(jù)田間葉枯病情況，選擇‘JIC1060003’（抗）和‘JIC1060007’（感）作為親本配置了雜交并獲得了遺傳群體。

2.2 菌的形態(tài)鑒定

使用貼片法在PSA培養(yǎng)基平板上共分離到兩種真菌以及酵母。通過(guò)科赫氏法則及葉片病原菌的活體（in vivo）觀(guān)察（圖2a）顯示只有一種真菌為葉枯病的致病菌。按1.3中的方法進(jìn)行葉片接種72h后，接種部位呈現(xiàn)褪綠，中心且有褐色斑點(diǎn)，并在顯微鏡下觀(guān)察到菌絲（圖2a）。菌株在PSA平板上生長(zhǎng)速率為0.5～0.6cm／d，菌落第2～3天為白色，之后中央出現(xiàn)灰黑色區(qū)域，氣生菌絲白色絨毛狀。鏡檢發(fā)現(xiàn)，其分生孢子梗單生或叢生，直立，黃褐色，大小為（17～27）μm ×（3～6）μm （圖2c）。分生孢子單生或2～4個(gè)串生，褐色，卵圓形或橢圓形，喙較短，大小（15～89）μm ×（7～30）μm，1～6個(gè)橫膈膜，1～4個(gè)縱隔膜。根據(jù) Andersen［3－4，10］等人的描述，此菌屬于鏈格孢菌屬，但其種的特性需進(jìn)一步鑒定。

圖1 野生二粒小麥葉枯病表型Fig.1 Phenotypes of the leaf blight and spot in Triticum dicoccoides

圖2 從感病葉片中分離的葉枯病病菌表型特征Fig.2 Morphology of the pathogen isolated from leaves of the susceptible genotype of T.dicoccoides‘JIC1060007’

2.3 病菌的分子生物學(xué)鑒定

為了進(jìn)一步確認(rèn)所分離的鏈格孢菌的類(lèi)群，對(duì)核糖體5.8SrDNA以及側(cè)翼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增和進(jìn)化分析。兩對(duì)真菌通用引物（ITS1、ITS4，ITS4、ITS5）PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，500～750bp間有明顯的擴(kuò)增條帶，且ITS1、ITS4產(chǎn)物長(zhǎng)度稍小于ITS4、ITS5（圖3a，泳道5～8）。進(jìn)一步對(duì)ITS4、ITS5產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序后顯示其長(zhǎng)度為595bp。按1.5中的方法進(jìn)行進(jìn)化分析。盡管本試驗(yàn)中所測(cè)序列有單個(gè)核苷酸的差異（以ITS5－1，6和10三個(gè)代表克?。?，但均屬于A(yíng).alternata類(lèi)群（圖3b）

圖3 病菌5.8SrDNA基因及其側(cè)翼ITS序列的檢測(cè)以及鏈格孢屬不同種的進(jìn)化分析Fig.3 Detection and phylogeny analysis of 5.8SrDNA gene and flanking ITS sequence

2.4 遺傳群體F2∶3家系中葉枯病表型鑒定以及抗病基因的遺傳特性分析

用本實(shí)驗(yàn)室分離的具有致病性的病原菌，在實(shí)驗(yàn)室條件下接種母本‘JIC106003’和父本‘JIC106007’以及252個(gè)F2∶3家系小麥，按1.6中的方法對(duì)病級(jí)進(jìn)行了分類(lèi)。在群體中植株表現(xiàn)為抗病的有64株系（圖4a，e），中抗的有128株系（圖4b），中感的有51株系（圖4c），感病的有8株系（圖4d）。

圖4 F2∶3家系中抗病性鑒定的表型特性以及AUDPC分布Fig.4 Different resistant phenotype to the pathogen among F2∶3family lines and the distribution of the AUDPC in F2∶3family lines

AUDPC分析表明，親本‘JIC1060003’AUDPC為839.98，表現(xiàn)為中等抗?。弧甁IC1060007’AUDPC為2592，表現(xiàn)為高感，F(xiàn)1單株的AUDPC平均983.58（2009年數(shù)據(jù)），與F2∶3家系平均數(shù)928.41接近。根據(jù)F1的表型，初步推測(cè)親本‘JIC106003’中的抗性基因?yàn)轱@性基因。F2∶3家系中的AUDPC分析表明（圖4e），部分株系表現(xiàn)為超親抗性（如67株AUDPC為0～500，小于抗性親本‘JIC1060003’），且抗性呈現(xiàn)偏態(tài)分布，以抗、中抗偏多。在F2：3家系中，以抗和中抗的株系數(shù)（193）對(duì)中感和感病的株系數(shù)（59，部分株系的AUDPC值接近1 500，表現(xiàn)為中感），χ2為0.256，符合一對(duì)性狀分離規(guī)律 （P＞0.05，小于＝3.84），因此認(rèn)為該親本組合中存在一對(duì)主效的顯性抗病基因。同時(shí)由于群體中的抗性存在超親個(gè)體，因此雙親中可能還存在作用較小的數(shù)量性狀和隱性的抗病基因，只有這些基因在后代中聚合且與抗性顯性基因一起時(shí)才表現(xiàn)為超親抗性。

3 討論

本研究應(yīng)用葉片病斑的形態(tài)觀(guān)察，孢子形態(tài)顯微觀(guān)察、科赫氏法則以及分子進(jìn)化分析等試驗(yàn)方法，證明了一株與鏈格孢屬的Alternaria alternata較為接近的真菌是參試野生二粒小麥葉枯病的致病菌，并通過(guò)遺傳學(xué)分析，表明抗病親本‘JIC106003’親本攜帶一對(duì)主效抗病基因，同時(shí)雙親中還可能存在數(shù)量性狀和隱性的抗病基因。

有關(guān)小麥鏈格孢葉枯病，我國(guó)研究者［4］認(rèn)為多種鏈格孢菌能引起葉枯病癥狀，并從菌絲和孢子的形態(tài)上進(jìn)行了描述。在國(guó)際上，Vergnes等［9］從小麥上分離到的4種鏈格孢菌A.triticina、A.alternata、A.tenuissima 和A.arborescens，只有 A.triticina能引起少數(shù)四倍體硬粒小麥的葉枯病，盡管該菌曾經(jīng)在20世紀(jì)60－70年代在印度引起大面積葉枯病，但后來(lái)的栽培品種對(duì)該菌都能免疫。該研究同時(shí)通過(guò)ITS1、5.8SrDNA和ITS2區(qū)序列比較對(duì)上述4個(gè)種進(jìn)行了分子進(jìn)化分析，來(lái)自A.triticina的序列與其他3種有明顯區(qū)分，其他3種序列也能各自聚類(lèi)，說(shuō)明能用該區(qū)的序列區(qū)分上述4種鏈格孢菌。因各地環(huán)境條件的差異，本試驗(yàn)首先按照科赫氏法則嚴(yán)格進(jìn)行了病原菌的分離、再接種與再分離和再接種等試驗(yàn)環(huán)節(jié)，證明了所分離的菌種確實(shí)引起供試品種的葉枯病癥狀，且通過(guò)兩次PCR擴(kuò)增ITS1、5.8SrDNA和ITS2區(qū)域進(jìn)行克隆測(cè)序，序列相似性99.9%以上，證明了所獲得的菌落是單菌落。根據(jù)Vergnes等［9］提交的序列，本研究中分離的鏈格孢序列屬于A(yíng).alternata類(lèi)群（圖3b）。因Vergnes等［9］只提交了4種小麥鏈格孢菌株的序列，而王洪凱等［11］對(duì)多種鏈格孢屬種的研究認(rèn)為，ITS1、5.8SrDNA和ITS2區(qū)域序列無(wú)法在種的水平上對(duì)鏈格孢屬進(jìn)行區(qū)分，因此本研究分離的菌株與Vergnes等的A.alternata供試菌株的區(qū)別尚待進(jìn)一步研究。

通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室可控條件下接種小麥葉片，表現(xiàn)出的病情排除了自然環(huán)境條件不穩(wěn)定的因素，試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)更能接近基因型的實(shí)際表現(xiàn)。經(jīng)過(guò)F1和F2：3家系病情分析，表明抗A.alternata葉枯病基因較為復(fù)雜，存在主效顯性抗病基因的同時(shí)還存在微效抗病基因，且可能以隱性的方式存在。為了進(jìn)一步鑒定抗病基因的遺傳規(guī)律，回交群體的創(chuàng)制正在進(jìn)行中。

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