趙李霞， 劉程國(guó)， 付 穎， 高 爽， 葉 非

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，哈爾濱 150030）

磺酰脲類除草劑由美國(guó)杜邦公司在20世紀(jì)80年代開發(fā)，是世界上品種最多、研究最為深入的一類除草劑，以高效、低毒、高選擇性的特性在全世界范圍內(nèi)得到廣泛使用［1］?；酋ｋ孱惓輨┰谑褂眠^程中最突出的問題就是對(duì)后茬作物的殘留藥害［2］。近年來，全球報(bào)道了多起因使用磺酰脲類除草劑導(dǎo)致作物發(fā)生藥害的事故，尤其是超高效磺酰脲類除草劑氯磺隆，在土壤中殘留期較長(zhǎng)，不易揮發(fā)和光解的特點(diǎn)，對(duì)后茬作物藥害嚴(yán)重，導(dǎo)致后茬的水稻、玉米或棉花受到藥害［3－4］。

針對(duì)磺酰脲類除草劑使用中的問題，人們提出使用安全劑來解除該類除草劑對(duì)作物的藥害［5］。Behringer等發(fā)現(xiàn)在苗后應(yīng)用安全劑雙苯惡唑酸和吡唑解草酯，能夠有效提高谷類作物對(duì)磺酰脲類除草劑的耐受性，使作物免受磺酰脲類除草劑的傷害［6］。郭玉蓮研究表明安全劑NA可通過誘導(dǎo)玉米體內(nèi)乙酰乳酸合成酶（ALS）、谷胱甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶（GST）活性，減輕氯嘧磺隆殘留對(duì)玉米的藥害［7］。葉非等人采用生物測(cè)定的方法研究安全劑AD－67保護(hù)玉米和高粱免受單嘧磺隆藥害的作用機(jī)理，結(jié)果表明：AD－67能夠提高單嘧磺隆處理后作物幼苗中的谷胱甘肽（GSH）含量和ALS活性，促進(jìn)單嘧磺隆與GSH的軛合作用［8－9］。研究者普遍認(rèn)為：安全劑能提高作物體內(nèi)GSH水平和GST活性，促進(jìn)GSH與磺酰脲類除草劑活性部位軛合，解除除草劑對(duì)靶標(biāo)酶的抑制，從而達(dá)到解毒的目的［10］。目前針對(duì)氯磺隆的安全劑研究剛剛起步，關(guān)于其作用機(jī)制的研究主要集中在對(duì)作物體內(nèi)GSH含量的影響，安全劑對(duì)氯磺隆作用的生理過程、解毒酶GST活性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)等的影響尚無報(bào)道，其確切的作用機(jī)制仍未闡明。

除草劑安全劑 R－28725（3－二氯乙?；?，2－二甲基－1，3－噁唑烷）是二氯乙?；鶉f唑烷類化合物，是酰胺類和硫代氨基甲酸酯類除草劑良好的解毒劑，也是潛在的磺酰脲類除草劑在禾本科作物田中的安全劑。本文通過生物測(cè)定方法研究了R－28725保護(hù)玉米免受除草劑氯磺隆藥害的作用，初步探討了保護(hù)作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑：20% 氯磺隆可濕性粉劑，江蘇溧陽市化工廠；R－28725，本課題組合成；TCA（三氯乙酸），北京順義永遂化工廠；DTNB（5，5－二硫代雙乙硝基甲酸）、TPP（硫胺素焦磷酸）、DTT（二硫代蘇糖酸醇）、GSH，Sigma化學(xué)試劑有限公司。

供試玉米品種：‘東農(nóng)253’，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

試驗(yàn)土壤：取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田1～15cm無污染的耕層土壤，過篩、自然風(fēng)干后使用。土壤pH為7.37，有機(jī)質(zhì)含量為2.37%。

儀器：ZRX－300D智能人工氣候培養(yǎng)箱（杭州錢江儀器設(shè)備有限公司）；T6新悅紫外－可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Sigma 3K30離心機(jī)（德國(guó)希格瑪離心機(jī)有限公司）；0K－98－ⅡA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰新特儀器有限公司）。

1.2 作物生長(zhǎng)條件

取定量過2mm篩的風(fēng)干土，加入氯磺隆，配制成0、2μg／kg的毒土，裝入紙杯。將精選的玉米種子用溫水浸泡30min，0.6%多菌靈浸泡30min，蒸餾水沖洗干凈后，用 R－28725溶液（0、5mg／kg）浸種12h，蒸餾水清洗干凈后，在培養(yǎng)箱內(nèi)催芽24h。選擇芽長(zhǎng)一致的玉米種子7粒，均勻擺放在藥土表面，上覆藥土，放置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（溫度26.5℃、濕度75%、光照與黑暗各12h循環(huán)培養(yǎng)）。每個(gè)處理濃度播種兩個(gè)紙杯。生長(zhǎng)7d后，用于各生理指標(biāo)的測(cè)定，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0系統(tǒng)處理。各處理重復(fù)3次。

1.3 GSH含量測(cè)定

取玉米幼苗的根0.2g，加1.2mL 5% 的TCA，在0～4℃下研磨，15 000g離心20min，取0.8mL離心后的上清液放入試管，加入1.6mL的磷酸鉀緩沖液（0.5mol／L，pH ＝8），加入16μL 10mmol／L的 DTNB顯色，在412nm 下測(cè)定A 值［11］。

1.4 GST活性以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

取玉米幼苗的根0.2g，加入1mL GST酶提取液在0～4℃下研磨，15 000g離心20min，上清液為待測(cè)酶液。

取0.5mL 3.0mmol／L GSH，加入2.3mL磷酸鉀緩沖液（0.1mol／L，pH ＝ 6.5），加入10μL上述待測(cè)酶液，最后加入20mmol／L溶于96%乙醇的CDNB 0.15mL，340nm 反 應(yīng)5min，每隔1min測(cè)定 A 值［12］。

25μL的CDNB（0.1～48mmol／L），900μL磷酸鉀緩沖液（0.1mol／L，pH ＝ 6.5），25μL的酶提取液，50μL的 G SH（100mmol／L，pH＝7.0），總體積1mL。GSH和CDNB的反應(yīng)產(chǎn)物可在分光光度計(jì)340nm下測(cè)定以計(jì)算GST活性。通過1／Vvs.1／S作圖，根據(jù)交點(diǎn)計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km［13］。

1.5 ALS的提取和活性測(cè)定

ALS的提?。喝?.0g玉米幼苗的葉，加入3.0mL ALS酶提取液，在0～4℃下研磨，25 000g離心20min，取上清液2.0mL用提取液定容至5.0mL。加入（NH4）2SO4粉末1.5g，振蕩均勻。沉降2h后，25 000g離心20min，棄去上清液，將沉淀溶于3.0mL酶溶解液中，即為酶提取液。

ALS酶活性測(cè)定：取0.4mL酶提取液，加入0.1mL磷酸鉀緩沖液（0.05mol／L，pH ＝7），再加入0.5mL酶反應(yīng)液，放入35℃恒溫水域中暗反應(yīng)1h，加入0.1mL 3mol／L的 H2SO4終止反應(yīng)，置于60℃恒溫水浴中脫羧反應(yīng)15min，然后加入0.5mL 0.5%的肌酸和0.5mL 5%甲萘酚，60℃顯色15min，冷卻后于525nm測(cè)定A值［14］。

蛋白質(zhì)測(cè)定方法采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 R－28725對(duì)玉米GSH含量的影響

使用R－28725浸種處理和氯磺隆毒土處理對(duì)玉米根部GSH含量的影響見表1。氯磺隆毒土處理使玉米GSH含量下降至對(duì)照的57.3%；使用R－28725浸種處理后，GSH含量恢復(fù)至空白的83.4%。結(jié)果表明：R－28725有效緩解了氯磺隆對(duì)玉米根部GSH含量的抑制作用。

表1 R－28725對(duì)玉米根部GSH含量的影響1）Table 1 Effects of R－28725on the GSH content of maize roots

除草劑在作物體內(nèi)的一個(gè)重要降解途徑是與GSH軛合形成低毒或無毒的軛合物，然后通過體內(nèi)的運(yùn)輸系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外或液泡，有效避免除草劑對(duì)作物造成的傷害［16］。因此作物體內(nèi)的GSH含量在一定程度上決定著安全劑對(duì)除草劑的解毒程度。R－28725能夠提高玉米中GSH含量，促進(jìn)GSH與氯磺隆軛合，解除氯磺隆在玉米體內(nèi)的活性，從而達(dá)到保護(hù)玉米免受氯磺隆藥害的目的。

2.2 R－28725對(duì)玉米GST活性的影響

使用R－28725浸種處理和氯磺隆毒土處理對(duì)玉米根部的GST酶活性影響見表2。用氯磺隆毒土處理時(shí)，玉米的GST酶活性比空白提高了5.1%；使用R－28725浸種處理后，玉米的GST酶活性比空白提高了191.8%，與對(duì)照相比差異顯著。

表2 R－28725對(duì)玉米根部GST酶活性的影響1）Table 2 Effects of R－28725on the GST activity of maize roots

1）表內(nèi)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，同列數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著。The data were the means of 3replicates；different letters in the same column indicate different significance levels of the difference.

GST可以催化GSH與各種內(nèi)源性和外源性化合物發(fā)生軛合，保護(hù)細(xì)胞不受氧化作用破壞，是作物體內(nèi)重要的解毒酶之一。氯磺隆作為外源化合物能誘導(dǎo)作物體內(nèi)GST活性增加，激發(fā)作物的自身抗逆功能；而R－28725可以大幅誘導(dǎo)玉米根部GST活性的增加，極大地提高作物體內(nèi)GSH與外源物的軛合水平，從而達(dá)到對(duì)氯磺隆的解毒目的。R－28725對(duì)玉米體內(nèi)GST酶活性和GSH含量的影響結(jié)果相一致，說明GSH軛合反應(yīng)是在GST催化下進(jìn)行的，即R－28725能夠提高GSH含量和GST活性，有利于催化軛合反應(yīng)的發(fā)生，從而快速解除除草劑氯磺隆對(duì)玉米的毒害作用［17］。

2.3 R－28725對(duì)GST酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

使用R－28725浸種處理和氯磺隆毒土處理對(duì)GST酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax和Km的影響見表3。氯磺隆毒土處理使Vmax減小40.5%，而R－28725浸種處理使Vmax增大102.5%。氯磺隆毒土處理使Km增大34.4%，而 R－28725浸種處理使 Km減小40.0%。結(jié)果表明：氯磺隆減小了GST酶對(duì)底物的親和力，而R－28725明顯增強(qiáng)了GST對(duì)底物的親和力。安全劑R－28725通過增強(qiáng)GST對(duì)底物的親和力，提高GST活性，能更好地催化GSH與除草劑氯磺隆的軛合反應(yīng)，解除除草劑對(duì)作物的毒害。

表3 R－28725對(duì)玉米根部GST酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的影響1）Table 3 Effects of R－28725on the GSTkinetic constants of maize roots

2.4 R－28725對(duì)玉米ALS酶活性的影響

使用R－28725浸種處理和氯磺隆毒土處理對(duì)玉米葉片ALS酶活性的影響見表4。單獨(dú)用氯磺隆毒土處理，葉片中的ALS酶活性比空白降低了37.3%；用R－28725浸種處理后，ALS酶活性得到明顯提高，比空白高出17.2%。R－28725能夠顯著提高玉米葉片中ALS酶活性，解除氯磺隆對(duì)玉米體內(nèi)ALS酶的抑制，保護(hù)玉米免受氯磺隆藥害。

表4 R－28725對(duì)玉米葉片中ALS酶活性的影響1）Table 4 Effects of R－28725on the ALS activity of maize roots

ALS是磺酰脲類除草劑作用的靶標(biāo)酶，氯磺隆可大大降低植物體內(nèi)ALS酶活性，抑制纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成，阻礙細(xì)胞分裂期間DNA的形成，使有絲分裂停止，細(xì)胞不能正常生長(zhǎng)，植物正常生長(zhǎng)受到破壞而死亡［18］。

3 結(jié)論

2μg／kg氯磺隆毒土處理對(duì)玉米的GSH含量和ALS活性產(chǎn)生了抑制作用；使用R－28725浸種處理可以基本解除氯磺隆對(duì)玉米生理指標(biāo)的抑制作用。結(jié)果表明：R－28725通過提高作物體內(nèi)GST活性，促進(jìn)GSH與除草劑的軛合反應(yīng)，這是R－28725減輕除草劑氯磺隆對(duì)玉米藥害的重要途徑之一；同時(shí)R－28725能夠激活除草劑靶標(biāo)酶ALS活性，逆轉(zhuǎn)除草劑對(duì)靶標(biāo)酶的抑制作用，從而達(dá)到解毒目的。

［1］ 黃春艷，陳鐵保，王宇，等.磺酰脲類除草劑對(duì)禾谷類作物的安全性及藥害研究［J］.植物保護(hù)，2005，31（1）：50－53.

［2］ Geisel B G L.The phytotoxic effect of ALS inhibiting herbicide combinations in prairie soils［D］.Saskatchewan：University of Saskatchewan，2007.

［3］ Amarjeet，Punia S S，Yadav A.Residual phytotoxicity of chlorsulfuron applied in wheat（Triticum aestivumL.）on succeeding crop of maize（Zea mays L.）［J］.The IUP Journal of Soil and Water Sciences，2009，2（4）：55－63.

［4］ 王險(xiǎn)峰，關(guān)成宏，范志偉.磺酰脲類除草劑安全性評(píng)價(jià)［J］.農(nóng)藥，2010，49（8）：547－564.

［5］ 邊強(qiáng)，寇俊杰，鞠國(guó)棟，等.磺酰脲類除草劑安全劑的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)藥，2011，50（10）：703－710.

［6］ Behringer C，Bartsch K，Schaller A.Safeners recruit multiple signalling pathways for the orchestrated induction of the cellular xenobiotic detoxification machinery in Arabidopsis［J］.Plant，Cell ＆ Environment，2011，34（11）：1970－1985.

［7］ 郭玉蓮.保護(hù)劑減輕氯嘧磺隆對(duì)玉米殘留藥害的作用機(jī)理［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（4）：645－649.

［8］ 葉非，付穎，徐偉鈞，等.安全劑AD－67減輕單嘧磺隆對(duì)高粱藥害的作用［J］.植物保護(hù)，2010，36（2）：105－108.

［9］ 葉非，付穎，徐偉鈞，等.安全劑AD－67保護(hù)玉米免受單嘧磺隆藥害的作用及其機(jī)理［J］.植物保護(hù)，2010，36（4）：90－93.

［10］ Fu Y，Yang M W，Ye F，et al.Glutathione S－transferase，acetolactate synthase and safener：a study to reduce herbicidal pollution［C］.The 5th International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering，2011，1：707－709.

［11］ Gronwald J W，F(xiàn)uerst E P，Eberlein C V，et al.Effect of herbicide antidotes on glutathione content and glutathione－S－transferase activity of sorghum shoots［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，1987，29（1）：66－76.

［12］ Jablonkai I，Hatzios K K.Role of glutathione and glutathione S－transferase in the selectivity of acetochlor in maize and wheat［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，1991，41（3）：221－231.

［13］ Scarponi L，Quagliarini E，Del Buono D.Induction of wheat and maize glutathione S－transferase by some herbicide safeners and their effect on enzyme activity against butachlor and terbuthylazine［J］.Pest Management Science，2006，62（10）：927－932.

［14］ Kobayashi K，Sugiyama H.Selective action of pyrazosulfuron－ethyl on growth and acetolactate synthase activity between rice and Cyperus serotinus［J］.Weed Research，1991，36（3）：251－256.

［15］ Nemat Alla M M，Hassan N M.Efficacy of exogenous GA3 and herbicide safeners in protection of Zea mays from metolachlor toxicity［J］.Plant Physiology and Biochemistry，1998，36（11）：809－815.

［16］ Del Buono D，Ioli G.Glutathione S－transferases of italian ryegrass（Lolium multiflorum）：activity toward some chemicals，safener modulation and persistence of atrazine and fluorodifen in the shoots［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（4）：1324－1329.

［17］ 葉非，徐偉鈞.除草劑安全劑的生理生化作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2008，35（4）：367－372.

［18］ Fan Z J，Chen J P，Hu J Y，et al.Activity of acetolactate synthase from maize（Zea mays L.）as influenced by chlorsulfuron and tribenuron－methyl［J］.Agricultural Science in China，2003，2（2）：176－182.