劉 限， 孫淑清， 高增貴， 黃 哲

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物免疫研究所，沈陽(yáng) 110866）

木霉具有快速生長(zhǎng)、強(qiáng)產(chǎn)孢能力、分泌多種細(xì)胞壁降解酶（纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等）和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力。大多數(shù)木霉都具有很強(qiáng)的根際或葉圍競(jìng)爭(zhēng)能力，能夠降解碳水化合物、酚復(fù)合物、多聚糖和在農(nóng)業(yè)上廣泛使用的各種異質(zhì)殺菌劑［1］。木霉的主要生防機(jī)制有重寄生［2］、抗菌物質(zhì)［3］、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)［4］和促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性［5］。與重寄生和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)相關(guān)的酶主要包括NAGase、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、β－1，3－葡聚糖酶、轉(zhuǎn)化酶和酯酶等，且不同木霉各種酶活性差異較大［6］，說明不同木霉在生防上發(fā)揮作用的機(jī)制是不同的。

限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合（restriction enzymemediated integration，REMI）技術(shù)可以用來轉(zhuǎn)化真菌［7］，從而隨機(jī)標(biāo)記基因，并可通過PCR技術(shù)和質(zhì)粒搶救等技術(shù)進(jìn)行基因克隆和功能分析［8－9］，從而探索功能基因間的相互作用和基因表達(dá)差異的機(jī)理。已有研究表明，木霉REMI突變株對(duì)番茄灰霉病的防治效果存在差異，說明不同的菌株間生防活性存在差異［10］。因此本研究以木霉REMI突變株為研究對(duì)象，篩選出主要生防酶（幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶）活性改變較大的菌株，研究幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶生防酶活性的變化及其基因部分序列存在的差異，以期為闡明木霉生防活性改變的分子機(jī)制提供新思路和理論依據(jù)，也為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高木霉生防活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：木霉菌株T21及其REMI突變株（Ttrm55、Ttrm68、Ttrm31、Ttrm94、Ttrm121、Ttrm123、Ttrm25、Ttrm76、Ttrm86），其中 REMI突變株是沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫研究所生物工程實(shí)驗(yàn)室通過REMI技術(shù)構(gòu)建并保存的。

1.2 木霉與番茄灰霉病菌的對(duì)峙培養(yǎng)

將番茄灰霉病菌菌片（6mm）接于PDA的平板邊緣，于28℃培養(yǎng)36h后再將轉(zhuǎn)化體和出發(fā)菌株T21對(duì)接于平板對(duì)面的邊緣，于28℃培養(yǎng)，并連續(xù)觀察菌落的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)3d后，測(cè)量灰霉病菌菌餅到菌落邊緣的距離r。計(jì)算抑制率I（%）＝（R－r）／R（R為對(duì)照中未接木霉的灰霉病菌菌餅到菌落邊緣的距離）。

1.3 生防酶－幾丁質(zhì)酶、β－1，3－葡聚糖酶活性測(cè)定

幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定參照顧向陽(yáng)的方法，以每毫升反應(yīng)混合物中每小時(shí)在37℃pH5.2條件下生成1μg N－乙酰葡糖胺為一個(gè)酶活單位U，比活性以每mg蛋白的酶活性單位表示（U／mg Protein）［11］。

β－1，3－葡聚糖酶活性測(cè)定參照高增貴的方法，以葡聚糖為底物，根據(jù)從葡聚糖中釋放出葡萄糖的量來測(cè)定酶活性［11］。

1.4 木霉不同REMI突變株與生防有關(guān)酶DNA序列間的差異

按照TRNzol試劑盒（天根）提供的方法提取木霉總RNA，檢測(cè)后按照TIANScript RT Kit試劑盒提供的方法進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后根據(jù)GenBank中關(guān)于哈茨木霉幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶的基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，幾丁質(zhì)酶（F：5′－AAGAAGCCAACCCACTTG－3′； R： 5′－GCATAGTCATAAGCCATCAGG－3′）和β－1，3－葡聚糖酶（F：5′－GCTCTTGCTCCTGGTGGTCGTTA－3′；R：5′－CAGGGTTGTTGCCAGCCATATT－3′），建 立20μL的PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1.5μL，上下游引物各1μL，2×Taq PCR Master－mix10μL，用ddH2O補(bǔ)足至20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋海?）95℃5min預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)；（2）95 ℃ 20s變性，β－1，3－葡聚糖酶60℃25s退火（幾丁質(zhì)酶54℃30s），68℃30s延伸，40循環(huán)；（3）68℃保溫5min，1循環(huán)；程序結(jié)束后進(jìn)入4℃狀態(tài)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送大連寶生物公司測(cè)序。然后利用NCBI網(wǎng)站提供軟件進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉REMI突變株對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用

由圖1可知，不同木霉REMI株對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用有顯著差異，其中抑制作用最強(qiáng)的是菌株Ttrm68，抑制率高達(dá)70.6%；其次為Ttrm34、Ttrm31、Ttrm76、T21、Ttrm25、Ttrm55、Ttrm121、Ttrm86；而Ttrm94抑制效果最差，抑制率僅達(dá)到39.2%。采用新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在1%水平上，木霉REMI轉(zhuǎn)化體菌株與出發(fā)菌株T21的差異極顯著。另外，在對(duì)峙試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同木霉REMI突變株對(duì)番茄灰霉病菌的作用方式也發(fā)生了變化，有的能夠覆蓋番茄灰霉病菌并在其上生長(zhǎng)（如菌株Ttrm68、Ttrm76和Ttrm34），有的不能覆蓋番茄灰霉病菌（菌株 Ttrm25、Ttrm31、Ttrm55、Ttrm121和Ttrm86及出發(fā)菌株T21）。綜合分析試驗(yàn)結(jié)果，篩選出Ttrm68、Ttrm25、Ttrm31、Ttrm94和 T21 5株對(duì)番茄灰霉病菌作用差異較大的木霉菌株，進(jìn)一步研究其主要生防酶的活性。

圖1 轉(zhuǎn)化體菌株對(duì)番茄灰霉病的拮抗作用Fig.1 The antagonism of different Trichoderma strains to Botrytis cinerea

2.2 不同木霉REMI突變株幾丁質(zhì)酶及β－1，3－葡聚糖酶的活性

5株木霉的幾丁質(zhì)酶及β－1，3－葡聚糖酶活性測(cè)定結(jié)果見圖2。結(jié)果表明不同木霉REMI突變株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶的比活性不同。各木霉REMI突變株菌株間酶活性及與出發(fā)菌株T21間均存在極顯著差異。其中活性最高的為菌株Ttrm68，其次為菌株Ttrm31，菌株Ttrm94的活性最低。菌株Ttrm68及菌株Ttrm31幾丁質(zhì)酶的活性均高于出發(fā)菌株T21，而菌株Ttrm25及菌株Ttrm94均低于出發(fā)菌株T21。由此可見不同木霉REMI突變株的幾丁質(zhì)酶活性存在很大差異。不同木霉REMI突變株產(chǎn)生的β－1，3－葡聚糖酶的比活性不同，突變株Ttrm68活性最高，菌株Ttrm31的β－1，3－葡聚糖酶活性略低于Ttrm68，菌株Ttrm94的β－1，3－葡聚糖酶活性最低。由此可以看出通過對(duì)峙篩選出的不同木霉菌株間幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶活性間存在差異，可以進(jìn)一步進(jìn)行其基因序列差異的分析。

圖2 木霉菌株幾丁質(zhì)酶及β－1，3－葡聚糖酶活性Fig.2 β－1，3－glucanase activity and chitinase activity of different Trichodermastrains

2.3 木霉不同REMI突變株幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶基因部分序列的差異比較

2.3.1 木霉菌株RNA的提取及幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶基因PCR產(chǎn)物檢測(cè)

從圖3可以看出28S和18S條帶明亮、清晰，且28SrRNA亮度明顯高于18SrRNA亮度，是其亮度的兩倍多，說明RNA質(zhì)量良好。以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板擴(kuò)增出β－1，3－葡聚糖酶和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的部分片段，其中β－1，3－葡聚糖酶基因片段大小為448bp，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因片段大小為374bp（圖4）。

2.3.2 木霉菌株幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶基因部分序列比較

將獲得的幾丁質(zhì)酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因的部分序列測(cè)序后，分別獲得有效序列為389個(gè)和280個(gè)堿基，利用Blast進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，這5株不同木霉中，幾丁質(zhì)酶基因中只有突變株Ttrm31和Ttrm68在限制性內(nèi)切酶SalI的酶切位點(diǎn)處插入了GGTATCGATATCGAC片段（圖5），使其基因序列發(fā)生變化；其余2株與出發(fā)菌株T21的序列完全一致。

圖5 木霉幾丁質(zhì)酶基因部分核酸序列Fig.5 Partial chitinase nucleotide sequences from different Trichodermastrains

由圖6可以看出，突變株Ttrm31和Ttrm68在限制性內(nèi)切酶SalI的酶切位點(diǎn)后插入了GIDID（分別是甘氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，異亮氨酸和天冬氨酸）5個(gè)氨基酸，使得這兩個(gè)氨基酸序列發(fā)生變化。而突變株Ttrm25和Ttrm94的氨基酸序列與出發(fā)菌株T21的一致，沒發(fā)生任何變化。說明REMI部分插入影響到部分木霉幾丁質(zhì)酶的基因，使其發(fā)生改變，進(jìn)一步導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變。由于幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，突變株Ttrm25和Ttrm94幾丁質(zhì)酶活性均低于出發(fā)菌株T21，推測(cè)可能由于插入到別的功能位點(diǎn)使其失效或減弱，從而造成酶活降低。突變株Ttrm68和Ttrm31酶活性均比出發(fā)菌株T21的高，所以推測(cè)插入處可能為其功能位點(diǎn)，增強(qiáng)了該酶的表達(dá)，該功能位點(diǎn)是一重要調(diào)控位點(diǎn)。

圖6 木霉幾丁質(zhì)酶氨基酸部分序列Fig.6 Partial chitinase amino acid sequences fromTrichodermastrains

5株木霉菌β－1，3－葡聚糖酶基因經(jīng) RT－PCR擴(kuò)增測(cè)序比較結(jié)果如圖7所示。突變株Ttrm94在限制性內(nèi)切酶XhoI的酶切位點(diǎn)處插入了GTC；而菌株Ttrm25、Ttrm31、Ttrm68的基因序列與出發(fā)菌株T21一致，均未發(fā)生變化。

由圖8可以看出，Ttrm94在限制性內(nèi)切酶XhoI的酶切位點(diǎn)后插入了R（精氨酸），精氨酸的側(cè)鏈帶有一個(gè)胍基，具有親水性，屬于功能基團(tuán)，而功能基團(tuán)對(duì)酶的活性起著重要的調(diào)節(jié)作用，從而可能改變了該菌株的β－1，3－葡聚糖酶的活性。

3 討論

由于限制性內(nèi)切酶消化片段對(duì)染色體的插入是隨機(jī)的，一旦插入于有意義序列或調(diào)控序列，則該序列控制的一系列性狀將產(chǎn)生突變［13］。目前REMI技術(shù)主要應(yīng)用于不同植物病原菌致病相關(guān)基因的研究［14－17］中，且有用于創(chuàng)造木霉菌株變異、篩選新生防菌株的報(bào)道［18］。本文在優(yōu)化哈茨木霉T21菌株原生質(zhì)制備、再生、轉(zhuǎn)化條件的基礎(chǔ)［19］上，利用REMI技術(shù)將外源質(zhì)粒DNA隨機(jī)插入到木霉的染色體中，從而使木霉中某些基因激活或者失活，篩選出主要生防酶活性不同的木霉REMI突變株，發(fā)現(xiàn)菌株間兩種生防酶的活性發(fā)生了極顯著的變化。幾丁質(zhì)酶活性提高的Ttrm68和Ttrm31菌株的酶氨基酸序列中插入了GIDID 5個(gè)氨基酸殘基，在插入的氨基酸中甘氨酸的側(cè)鏈較小，在許多蛋白質(zhì)構(gòu)象中起著獨(dú)特作用；而天冬氨酸屬酸性氨基酸，含有β－羧基，帶負(fù)電，且經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子表面，是構(gòu)成酶的活性中心的氨基酸［19］?？赡苡捎谶@些活性基團(tuán)的加入，從而使酶活性升高。菌株Ttrm68的活性高于菌株Ttrm31可能由于在別的功能位點(diǎn)處同樣插入了能提高酶活的功能基團(tuán)。β－1，3－葡聚糖酶活性降低的Ttrm94菌株其酶氨基酸序列中插入了R，可能由于精氨酸插入到β－1，3－葡聚糖酶的催化部位或結(jié)合部位，使其結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，影響其與底物結(jié)合，也可能由于極性基團(tuán)的影響改變其帶電狀態(tài)，使酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域或催化活性中心的電荷發(fā)生變化，從而使酶活性改變［20－21］。當(dāng)然或許有其他位點(diǎn)也發(fā)生了改變?cè)斐擅富钚愿淖?，尚待進(jìn)一步的深入研究。其他菌株間酶活性變化也可能是在別處插入后導(dǎo)致功能位點(diǎn)活性提高（或）降低，這些都需要進(jìn)一步對(duì)這兩種酶的基因進(jìn)行克隆，獲得全序列進(jìn)行比對(duì)和分析，同時(shí)還需要對(duì)不同菌株產(chǎn)生的酶進(jìn)行分離純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)來進(jìn)一步探討其變化產(chǎn)生原因。

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