李發(fā)武 丁慧俊 王文琦 吳福全 殷思純 李婉霞 何松美 王艷娜

東莞市人民醫(yī)院感染內(nèi)科(廣東東莞，523059)

乙肝病毒 (HBV)感染的發(fā)病機制復雜，HBV基因組研究結果不能完全解釋HBV感染廣泛的疾病譜。即使相同的病毒分離株在感染不同宿主時，臨床表現(xiàn)和轉歸都有很大差異。HBV感染后的不同臨床結局與宿主相關基因的多態(tài)性有關［1～3］。我們的前期研究證實，IFN-α/β受體基因啟動子-408位點存在SNP，并與HBV感染不同臨床轉歸有關［4］。本研究試圖探索IFN-α/β受體基因多態(tài)性與IFN療效之間的關系，以期為制定治療方案和療效預測提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 210例CHB患者均為2009年12月至2012年3月在東莞市人民醫(yī)院住院或門診就診患者。入選標準按2000年中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會西安會議聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》CHB診斷標準［5］。年齡18～76歲，漢族。輕度38例、中度102例、重度70例即按輕、中、重度分為3組，所有研究對象均無親緣關系，無原發(fā)性心、肺、腎及高血壓等病史，排除其他慢性肝病的致病因素存在，如非HBV感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、脂肪肝等。對其中既往未用過IFN治療的80例CHB患者按適應癥給予Peg-IFN-α-2a/2b治療。

1.2 治療方案 Peg-IFN-α-2a，180μg/次，每周1次，皮下注射，療程48周;或Peg-IFN-α-2b，1.0～1.5μg/kg體重，每周1次，皮下注射，療程48周。具體劑量可根據(jù)患者的耐受性等因素進行調(diào)整。在治療前、治療期間及隨后均未使用其他抗病毒和免疫調(diào)節(jié)藥物。在治療0、12、24、36、48周及停藥24周時隨訪，并檢測其肝功能、HBV-M、HBV DNA、AFP、血常規(guī)、凝血酶原時間、甲狀腺功能及血糖等。

1.3 療效評價 SR［6］:療程結束及停藥24周時ALT正常，HBeAg陰性，HBeAb陽性，PCR檢測HBV DNA＜500 copies/ml。NSR:未達上述標準的任意一種情況。

1.4 引物設計與合成 從GenBank下載人IFN-α/β受體A亞單位基因全部序列登錄號:X60459(gi:32671)，應用 PRIMER5.0，設計引物:IFNAR1F(rs20358504-rs20358521 ): TCCAAGGGACCATCTCGC，IFNAR1R (rs20359218-rs20359199):GCAGATCCCACCAGTTACAT，基因片段間含-408位點，由廣州市金域生物技術有限公司合成，PCR及基因測序。

1.5 人類基因組DNA提取 取EDTA抗凝靜脈血2 ml，分裝，－20℃凍存，采用 Roche提供 ActiTaq DNA polymerase基因組提取試劑盒提取基因組DNA，－20℃分裝凍存。

1.6 PCR條件 PCR擴增反應體系均為20μl，10×PCR Bufer(含 鎂 離 子)1.5μl，25mmol/L dNTP 0.5μl，目 的 引 物 各 10μmol/L 0.1μl，內(nèi) 參 引 物10μmol/L 0.16μ1，DNA 提 取 物 100ng/μl 0.5μl，TaqDNA 聚合酶 1U/μl 0.2μl，加去離子水至 15μl。把PCR反應管置PCR儀中，94℃預變性5分鐘后進入循環(huán)擴增，即先94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，重復35個循環(huán)后，于72℃再延伸7分鐘。

1.7 擴增產(chǎn)物基因型分析 直接測序，用Chromas軟件分析測序結果，與參考序列X60459進行比對。

1.8 統(tǒng)計學方法 全部數(shù)據(jù)輸入計算機，用SPSS 16.0軟件分析，等位基因和基因頻率采用直接計數(shù)法，組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。統(tǒng)計學顯著性檢驗為雙側，檢驗的顯著性界限水平為0.05。

2 結果

2.1 IFN-α/β-408位點SNP分布 基因型頻率分析符合 Hardy-Weinberg定律。IFN-α/β-408位點存在CC、CT、TT 3個基因型，C、T兩個等位基因，分布頻率見表1。210例CHB患者IFN-α/β-408位點基因型頻率為CC純合型111例 (52.9%)，CT雜合型69例 (32.9%)，TT純合型30例 (14.3%)。等位基因C頻率 291(69.3%)，T頻率 129(30.7%)。CHB患者輕、中、重度各組間基因型分布頻率比較(χ2=1.991，P=0.737)及等位基因分布頻率比較(χ2=1.888，P=0.389)差異均無顯著性意義。

表1 IFNα/-β-408位點多態(tài)性的基因型及等位基因頻率分布

2.2 IFN-α/β-408位點基因型、等位基因頻率與IFN應答的關系 見表2。80例CHB患者經(jīng)Peg-IFN-α-2a/2b治療的應答情況為 SR組 33例(41.3%)，NSR組47例 (58.7%)，在兩組患者中，均檢出 IFN-α/β-408位點 CC、TT、CT基因型。CT基因型患者IFN治療持久應答率為65%(13/20)，顯著高于CC基因型患者的29.5%(13/44)，兩者相比差異有顯著性意義 (χ2=7.166，P=0.007)。χ2檢驗和Fisher確切概率法檢驗結果表明，IFN治療SR組IFN-α/β-408位點等位基因C、T的頻率與NSR組的頻率比較，差異無顯著性意義 (P＞0.05)。

表2 IFNα/-β-408位點多態(tài)性的基因型及等位基因與IFN應答的關系

3 討論

Peg-IFN-α是CHB的主要治療藥物之一，其誘導機體產(chǎn)生抗病毒效應需要兩個重要的條件:一是與細胞膜上特異性受體結合，二是與受體結合后發(fā)生細胞內(nèi)信號轉導，通過激活下游的JAK-STAT等信號途徑，導致一系列IFN誘導的抗病毒蛋白基因的表達，產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，從而達到抗病毒作用。

臨床上，應用IFN治療的人群往往應答效果差異很大。研究發(fā)現(xiàn)，除了病毒變異、肝炎活動度或ALT值、性別、年齡及宿主的免疫狀態(tài)等影響IFN-α療效外，宿主IFN遺傳通道上眾多基因的SNP也是影響IFN 應答的重要因素［7，8］。

外源性和內(nèi)源性IFN-α均需要與靶細胞上特異性IFN-α/β受體結合，才能產(chǎn)生抗病毒作用和調(diào)節(jié)機體免疫功能。IFN-α/β受體基因具有多態(tài)性，基因型不同導致IFN-α/β受體表達差異，從而影響HBV感染后臨床結局，并可能對IFN-α抗病毒效應產(chǎn)生影響。樊和斌等［9］發(fā)現(xiàn)，IFN受體表達水平在不同臨床型慢性肝病患者中有顯著差異。何生松等［10］發(fā)現(xiàn)IFN治療CHB患者其療效與細胞膜上IFN-α/β受體表達水平密切相關。Lee CM等［11］發(fā)現(xiàn)慢性丙型肝炎患者肝組織內(nèi)IFN受體的表達量 (mRNA)與IFN的持續(xù)應答率有關。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)［4］，IFN-α/β受體基因-568位點和-408位點的多態(tài)性與HBV感染不同的臨床結局具有明顯的相關性，攜帶-408CC基因型的患者容易進展為CHB甚至肝硬化。提示-408CC基因型是慢性活動性肝病的易感基因型。

有關IFN-α/β受體基因多態(tài)性對 IFN-α療效影響的臨床研究尚未見報道。為此，我們探索了IFN-α/β受體基因-408位點多態(tài)性與IFN療效的相關性。結果顯示，210例CHB患者IFN-α/β-408位點基因型頻率為CC純合型111例 (52.9%)，TT純合型30例 (14.3%)，CT雜合型69例 (32.9%)，408位點CC基因型與CHB高危可能相關。

Peg-IFN-α-2a 與 Peg-IFN-α-2b 已批準用于治療CHB。兩者可取得類似的HBV DNA抑制率、HBeAg血清學轉換率和 HBsAg清除率［6，11］。本研究中，80例符合適應癥的患者，其治療結果提示IFN-α/β受體啟動子-408為CT雜合基因型的CHB患者可能對Peg-IFN治療效果較好。盡管如此，IFN-α/β受體啟動子-408位點多態(tài)性與IFN-α/β受體 mRNA及受體蛋白表達水平的關系有待進一步闡明。

［1］ ZHOU J，LU L，YUEN MF，et al.Polymorphisms of type 1 interferon receptor 1 promoter and their effects on chronic hepatitis B virus infection ［J］ .J Hepatol，2007，46(2):198-205.

［2］ KIM SS，CHEONG JY，LEE D，et al.Interleukin-1β and interleukin-1 receptor accessory protein gene polymorphisms are associated with persistent hepatitis B virus infection ［J］ .Hepatogastroenterology，2012，59(113):190－197.

［3］ CMET S，F(xiàn)ABRIS C，F(xiàn)ATTOVICH G，et al.Carriage of the EGF rs4444903 A＞G functional polymorphism associates with disease progression in chronic HBV infection ［J］ .Clin Exp Immunol，2012，167(2):296－302.

［4］丁慧俊，李發(fā)武，何松美，等.干擾素-α/β受體基因多態(tài)性與HBV感染結局的關系 ［J］.中西醫(yī)結合肝病雜志，2011，21(6):340－342.

［5］中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案［J］.中華肝臟病雜志，2000，8(6):324－329.

［6］中華醫(yī)學會肝病學分會、中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南［J］.肝臟，2011，16(l):2－16.

［7］ KOBAYASHI M，SUZUKI F，AKUTA N，et al.Association of two polymorphisms of the IL-28B gene with viral factors and treatment response in 1，518 patients infected with hepatitis C virus［J］ .J Gastroenterol，2012，47(5):596 －605.

［8］ SUZUKI F，ARASE Y，SUZUKI Y.Single nucleotide polymorphism of the MxA gene promoter influences the response to interferon monotherapy in patients with hepatitis C viral infection ［J］ .J Viral Hepatitis，2004，11(11):271－276.

［9］樊和斌，郭亞兵，吳愛華，等.干擾素α/β受體慢性乙型肝炎肝組織的免疫組化定位［J］.世界華人消化雜志，2005，13(4):580－581.

［10］何生松，湯群，李淑莉.慢性乙型肝炎患者IFN-α/β受體和細胞因子表達與干擾素療效間的關系［J］.中西醫(yī)結合肝病雜志，2005，15(3):142－145.

［11］ BUSTER EH，F(xiàn)LINK HJ，CAKALOGLU Y，et al.Sustained HBeAg and HBsAg loss after long-term follow-up of HbeAg-positive patients treated with peginterferon alpha-2b ［J］ .Gastroenterol，2008，135(2):459－467.