孫 鵬，梁彥秋，張立華，鄧 斌，臧樹良

（1.遼寧科技大學(xué) 化工學(xué)院，遼寧 鞍山 114051；2.沈陽化工學(xué)院 環(huán)境與生物系，遼寧 沈陽 110142；3.遼寧大學(xué) 化學(xué)系，遼寧 沈陽 110036）

在生物體內(nèi)，各類小分子（含中性分子和離子）物質(zhì)的生物活性功能都是通過它們與生物大分子相互作用體現(xiàn)的，小分子物質(zhì)與生物大分子之間的相互作用是探索各類小分子生物學(xué)效應(yīng)和功能的基本途徑之一［1］。在生產(chǎn)實(shí)踐和科學(xué)研究中，常常存在作為兩性小分子物質(zhì)的表面活性劑和蛋白質(zhì)相互作用問題，相關(guān)研究己引起廣泛關(guān)注［2－3］；蛋白質(zhì)與表面活性劑的復(fù)配體系還被用于模擬生物酶催化體系，對加快生物技術(shù)向化工、醫(yī)藥等傳統(tǒng)領(lǐng)域的滲透和應(yīng)用具有重要意義。

試驗(yàn)選用牛血清白蛋白（BSA）與陽離子表面活性劑溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）、陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）之間的相互作用，借助光譜法和熱力學(xué)方法，研究了它們之間的作用機(jī)制，確定了2種表面活性劑與牛血清白蛋白之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合過程的基本熱力學(xué)參數(shù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF－5301熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；UV－8453紫外分光光度計(jì)（日本日立公司）；Spectrum GX1型傅立葉變換紅外光譜儀（英國Perkin Elmer公司）；AY－122電子分析天平（上海菁華）；pHs－3G型酸度計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

BSA（上海伯奧生物科技有限公司）生化試劑，CTAB（上海試劑公司），SDBS（上海試劑公司），三（羥甲基）氨基甲烷（北京化學(xué)試劑公司）；氯化鈉（重慶國藥試劑公司）。除BSA外，所用試劑均為分析純，水為二次去離子水，無熒光雜質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

將1.0×10－6mol／L的BSA溶液3.0mL加入石英比色皿中，然后逐次加入CTAB溶液，控溫298K和310K，分別測定不同溫度下的發(fā)射光譜。室溫下測定CTAB、BSA與CTAB濃度比分別為1∶0、1∶1、1∶3、1∶5的紫外吸收光譜。在一定激發(fā)和發(fā)射波長范圍內(nèi)，間隔4nm，測定BSA及BSA與CTAB作用產(chǎn)物的三維熒光光譜。用ATR附件測定BSA溶液的紅外光譜和緩沖溶液的紅外光譜，再用差減軟件差減去緩沖溶液的紅外光譜，得到BSA溶液的紅外光譜。同樣方法得到加入CTAB作用后的蛋白質(zhì)的紅外光譜。用相同方法測定SDBS與牛血清白蛋白的相互作用。

2 結(jié)果與討論

2.1CTAB、SDBS與BSA相互作用后的熒光光譜

由圖1看到，分別滴加CTAB和SDBS后，BSA的熒光猝滅光譜強(qiáng)度隨CTAB和SDBS濃度增大而被強(qiáng)烈猝滅。表明它們都可以與BSA相互作用，但SDBS的猝滅強(qiáng)度更大一些。

圖1 CTAB（a）和SDBS（b）對BSA的熒光猝滅光譜

2.2 猝滅類型和猝滅常數(shù)

熒光猝滅作用因猝滅機(jī)制不同可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅［4］。動態(tài)猝滅過程中，當(dāng)猝滅體分子和熒光物質(zhì)分子之間形成新的復(fù)合物而發(fā)生靜態(tài)猝滅時(shí)，服從 Lineweaver－Burk方程［4－5］，KA為結(jié)合常數(shù)。不同溫度下，表面活性劑對BSA的猝滅作用數(shù)據(jù)見表1?？梢钥闯?，不同溫度下的Kq遠(yuǎn)大于最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L／（mol·S）［6］，且表面活性劑對BSA的猝滅常數(shù)Ksv隨溫度升高而降低，表明猝滅過程為靜態(tài)猝滅。SDBS的KA大于CTAB的KA，表明SDBS與BSA的結(jié)合能力要強(qiáng)于CTAB與BSA的結(jié)合能力。

表1 方程的相關(guān)系數(shù)、猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)

2.3 作用力的類型

有機(jī)小分子和生物大分子之間的結(jié)合力主要有氫鍵、Van der Waals力、疏水作用力和靜電引力等，根據(jù)文獻(xiàn)［6］計(jì)算出的反應(yīng)的ΔG、ΔH 和ΔS見表2。

表2 CTAB、SDBS與BSA作用的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)

依據(jù)Ross等［7］總結(jié)的判斷生物大分子與小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，由表2數(shù)據(jù)判斷，在生理?xiàng)l件下，這2種表面活性劑與BSA之間的作用力可能主要是氫鍵和范德華力，二者之間沒有太大差別。

2.4 紫外吸收光譜比較

圖2為2種表面活性劑對BSA紫外吸收光譜的影響。BSA在210nm和278nm顯示有2個(gè)特征的蛋白質(zhì)吸收峰。BSA在加入不同濃度的CTAB后，在210nm處的吸收光譜呈減色效應(yīng)，說明CTAB與BSA發(fā)生了較強(qiáng)的作用，使蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象改變，α－螺旋含量減少［8］。SDBS也發(fā)生了相同的現(xiàn)象。

圖2 CTAB（a）和SDBS（b）對BSA吸收光譜的影響

2.5 三維熒光

圖3是CTAB、SDBS作用于BSA的三維熒光光譜圖。

圖3 BSA（a）和BSA－CTAB體系（b）的三維熒光光譜

圖3的峰有“山脊”形峰，為瑞利散射峰和“駝峰”形峰，為熒光峰（峰1和峰2）。加入CTAB后，瑞利散射峰的強(qiáng)度稍有變化，歸因于溶液中溶質(zhì)和溶劑所處的環(huán)境發(fā)生了變化。BSA的峰1和峰2的熒光強(qiáng)度降低，發(fā)射波長藍(lán)移。SDBS也發(fā)生了相同的現(xiàn)象。峰1和峰2強(qiáng)度降低的程度不一樣，很顯然，表面活性劑對峰2的猝滅作用更為明顯。BSA的幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內(nèi)部，構(gòu)成疏水腔［9］，表面活性劑分子的結(jié)合部位可能都處于這種疏水腔中，表面活性劑分子的引入導(dǎo)致這種疏水微環(huán)境極性發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致BSA構(gòu)象發(fā)生變化［10］。

表3 CTAB、SDBS作用BSA前后三維熒光光譜的變化

2.6 紅外光譜

從圖4看出，當(dāng)CTAB濃度與牛血清白蛋白的濃度比為1∶1時(shí)，蛋白質(zhì)在1 647cm－1和1 546 cm－1處有負(fù)峰出現(xiàn)，表明BSA與CTAB之間發(fā)生了作用；隨CTAB濃度增大，2個(gè)吸收峰的強(qiáng)度增大。說明CTAB的加入引起了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，1 650cm－1附近的負(fù)峰顯示α－螺旋結(jié)構(gòu)降低［11］。SDBS的加入也有相同的現(xiàn)象。

圖4 BSA及BSA與CTAB作用產(chǎn)物的紅外光譜

3 結(jié)論

BSA中加入表面活性劑后，其熒光光譜和紫外光譜都發(fā)生了變化，表明這2種表面活性劑均與BSA發(fā)生了反應(yīng)。CTAB與BSA的結(jié)合常數(shù)小于SDBS與BSA的結(jié)合常數(shù)，這是由于頭基在活性劑與大分子結(jié)合過程中占有重要地位：當(dāng)BSA分子上的特性結(jié)合位完全被CTAB飽和后，CTAB所具有的體積較大的極性頭基阻礙了CTAB的非極性基與BSA的特異性結(jié)合，使得CTAB在BSA上的結(jié)合量較SDBS在BSA上的結(jié)合量要小。BSA與這2種表面活性劑之間的作用力主要為氫鍵和范德華力。三維熒光光譜表明，CTAB和SDBS的加入改變了BSA的有序結(jié)構(gòu)；而紅外光譜表明，CTAB和SDBS加入后，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致BSA中α－螺旋含量降低。

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