陳鶴 于斌 陳丹妮 李恒 牛憨笨

(深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)(教育部/廣東省)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)

(2013年3月7日收到;2013年3月29日收到修改稿)

1 引言

得一了種

近較是年大基來的于,發(fā)縮遠(yuǎn)展小場有[1納].效米目激分前發(fā)辨最光熒為斑突光,出顯 通的微 過方成 直法像 接有技 減兩術(shù) 小種取點(diǎn),擴(kuò)展函數(shù)的半高寬來提高分辨率,包括受激輻射耗盡(stimulated emission depletion,STED)、基態(tài)耗盡(ground state depletion,GSD)、飽和結(jié)構(gòu)激發(fā)顯微術(shù)(saturated pattern excitation microscopy,SPEM)等;另一種則是基于單分子定位技術(shù),包括隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)、光敏定位顯微術(shù)(photoactivated localization microscopy,PALM)及熒光PALM(fl uorescence photoactivation localization microscopy,fPALM)等.前者是利用受激態(tài)或基態(tài)耗盡的方式,壓縮熒光有效發(fā)射區(qū)域;后者則是利用熒光標(biāo)記本身的開關(guān)效應(yīng),通過稀疏激發(fā)、分時(shí)成像、質(zhì)心定位以及圖像合成來實(shí)現(xiàn)納米分辨成像,并已經(jīng)實(shí)現(xiàn)20 nm的橫向空間分辨率成像.

然而,傳統(tǒng)的單分子定位方法只能對(duì)分子進(jìn)行二維也就是橫向定位,但對(duì)于軸向分辨率并沒有提高.結(jié)合某些改進(jìn)軸向分辨率的方法,如柱面鏡定位[2]、雙焦面探測[3]、雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)法(double helix point spread function,DH-PSF)[4]以及熒光干涉法[5]等,能將軸向分辨率提高到50 nm的水平.其中,DH-PSF是通過特殊設(shè)計(jì)相位板,改變系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)形成雙螺旋的形式,并且旋轉(zhuǎn)的方向與熒光分子的軸向位置有關(guān),從而獲得熒光分子的軸向定位.該方法具有相比其他方法更長的可探測焦深范圍,并且在整個(gè)成像深度內(nèi),點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的形狀近似不變,僅隨軸向位置發(fā)生旋轉(zhuǎn),而不像其他方法需要通過精確形狀圖像比對(duì)來得到軸向位置,從而定位精度可以做得更高.

考慮到單分子定位超分辨方法中,定位精度直接決定了其極限分辨率,因此有必要對(duì)DH-PSF的三維定位精度進(jìn)行詳細(xì)的分析.本文通過兩種方法來分析DH-PSF的三維定位精度：首先,基于費(fèi)希爾信息量(Fisher information,FI)理論分析了DH-PSF的三維FI理論定位精度;此外,基于高斯擬合質(zhì)心定位算法,利用誤差傳遞理論求得DH-PSF的三維模擬質(zhì)心定位精度,并對(duì)二者進(jìn)行了比較和分析.結(jié)果表明,在光子數(shù)大于1000的情況下,二者得到的定位精度接近.本文重點(diǎn)分析了光子數(shù)、背景噪聲、軸向位置對(duì)定位精度的影響,這將對(duì)于DH-PSF的三維定位實(shí)驗(yàn)提供理論指導(dǎo).

2 DH-PSF實(shí)現(xiàn)三維納米定位原理

DH-PSF實(shí)現(xiàn)三維納米定位是基于一種被稱為自成像的現(xiàn)象.DH-PSF是一種三維光學(xué)響應(yīng),具有隨離焦量不斷旋轉(zhuǎn)的圓形不對(duì)稱橫截面輪廓.實(shí)現(xiàn)DH-PSF的主要方法是通過位于Laguerre-Gauss(LG)模式平面上特定直線上的LG模式的線性疊加.LG光束模式的線性疊加構(gòu)成自成像光束.LG光束模式為[6]

式中r=(ρ,φ,z)為空間點(diǎn)的柱坐標(biāo),ρ?=ρ/ω(z?)是高斯光斑的經(jīng)向坐標(biāo),為束腰半徑,z?=z/z0縱向坐標(biāo),z0=πω02/λ為瑞利長度,un,m(r)的組成為

將(1,1),(3,5),(5,9),(7,13),(9,17)五個(gè)LG模式進(jìn)行等權(quán)重疊加,形成一個(gè)新的光場分布函數(shù),即雙螺旋旋轉(zhuǎn)光束(圖1(a)).基于LG函數(shù)的傅里葉變換不變特性,該函數(shù)如作為光學(xué)傳遞函數(shù)應(yīng)用到光學(xué)成像系統(tǒng)中,光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)將變?yōu)镈H-PSF,且隨離焦量變化而旋轉(zhuǎn)的速度與LG模式平面上所選取的直線斜率成正比,在聚焦區(qū)速度最大(圖1(c)).一個(gè)DH-PSF系統(tǒng)是在標(biāo)準(zhǔn)成像系統(tǒng)的傅里葉平面加入一個(gè)特殊設(shè)計(jì)的相位板,此相位板是其透射率函數(shù)在傅里葉變化的聚焦區(qū)形成雙螺旋的形式.更特別的是它展示了兩個(gè)圍繞著光軸旋轉(zhuǎn)的旁瓣,其中一個(gè)繞著光軸順時(shí)針旋轉(zhuǎn),而另一個(gè)則是逆時(shí)針旋轉(zhuǎn).用DH-PSF進(jìn)行三維納米定位時(shí),分子的橫向定位點(diǎn)通過兩個(gè)旁瓣的中點(diǎn)來估計(jì),而其軸向位置則根據(jù)兩個(gè)旁瓣中心連線的旋轉(zhuǎn)角度(圖1(b))確定[7].

3 基于FI理論計(jì)算DH-PSF的三維定位精度

FI是一種測量隨機(jī)變量X與取決于X概率的未知參數(shù)θ的信息量.X的概率函數(shù)也就是θ的似然函數(shù),記作 f(X,θ).似然函數(shù)的對(duì)數(shù)對(duì)θ的偏導(dǎo)數(shù)叫作得分函數(shù).在特定的條件下,得分函數(shù)的一階矩為0,二階矩為FI,則FI表達(dá)式為

圖1 DH-PSF (a)DH-PSF的強(qiáng)度與相位分布;(b)DH-PSF兩個(gè)旁瓣的旋轉(zhuǎn)角度與Z軸位置的關(guān)系曲線圖舉例;(c)DH-PSF在不同軸向位置處的圖形

就基于DH-PSF的單分子定位而言,似然函數(shù)就是DH-PSF,感興趣的參量就是單分子的橫向和軸向位置根據(jù)Cramer-Rao不等式,一個(gè)未知參數(shù)θ的無偏估計(jì)值θ?的變化往往大于或者等于FI逆矩陣[8].

DH-PSF的Cramer-Rao邊界(Cramer-Rao bound,CRB)代表了無偏估計(jì)值的最小可能位置的估計(jì)方差,通過選擇適當(dāng)?shù)脑肼暦植?可計(jì)算不同信噪比下的CRB.對(duì)于單分子的3D定位問題,3D定位精度的極限為FI逆矩陣的對(duì)角線元素的平方根,其計(jì)算如下[9]：

其中θ=(x0,y0,z0),μθ為PSF在每個(gè)像素點(diǎn)上的概率密度函數(shù),β為每個(gè)像素點(diǎn)上的泊松背景噪聲,K為總的像素?cái)?shù).

則其光子受限系統(tǒng)中的CRB為

由前面可知3D的定位精度與CRB的平方根是一致的,所以光子受限系統(tǒng)中的三維定位精度表達(dá)式如下：

為了計(jì)算DH-PSF的FI矩陣,我們必須求解成像函數(shù)的PSF及其偏導(dǎo)數(shù).在基于雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的熒光顯微系統(tǒng)中,位于點(diǎn)(0,0,z)處的熒光分子所成的像,即為系統(tǒng)的DH-PSF,其3D-PSF數(shù)學(xué)模型如下[10,11]：

把qz(x,y)代入(9)—(12)式得：

i,j=1,2,3;θ∈{x,y,z},N表示總光子數(shù),B為背景噪聲.

為了計(jì)算DH-PSF的理論定位精度,我們重點(diǎn)分析了光子數(shù)、背景噪聲、軸向位置對(duì)其定位精度的影響.所有的理論定位精度的模擬計(jì)算均在Matlab編程環(huán)境下實(shí)現(xiàn).模擬參數(shù)如下：熒光波長λ=670 nm,物鏡放大倍率M=100,數(shù)值孔徑N=1.4,探測器像元大小為16μm.通過探測光子數(shù)的不同,可以分別求出其不同的三維定位精度,如圖2(a)所示.由于定位精度與光子數(shù)的開方成反比,所以隨著光子數(shù)的增加,所求得的W(θ)值就越小,也就是其定位精度越高.如圖2(b)所示,光子數(shù)為1000時(shí),通過所加背景噪聲的不同,可以分別求出其不同的三維定位精度.隨著背景噪聲的增加,定位點(diǎn)的分布就越寬,所求得的W(θ)值就越大,也就是其定位精度越低.光子數(shù)為1000和5000時(shí),通過z的取值不同(-1—1μm),可分別求得各個(gè)位置處的三維定位精度,如圖2(c)—(e)所示.在x,y軸定位精度上,由于其橫向定位精度與光斑的大小有關(guān),光斑越小其定位精度就越高.在不同的z軸位置上,最中間的光斑最小,旁邊的都隨著離焦而有所增大,所以在中點(diǎn)位置的定位精度最高,隨著中點(diǎn)依次降低;在z軸定位精度上,其定位精度不僅與光斑尺寸有關(guān),還與兩個(gè)光斑之間的距離有關(guān),距離越遠(yuǎn)定位精度越高.離焦越遠(yuǎn),兩個(gè)點(diǎn)之間的距離越大,所以在中點(diǎn)位置的定位精度最低,隨著中點(diǎn)依次升高.通過對(duì)軸向及橫向定位精度隨分子所處離焦量的變化曲線可以看到,在焦點(diǎn)位置,橫向定位精度達(dá)到最高,而軸向定位精度最低.

圖2 DH-PSF定位精度模擬圖 (a)不同光子數(shù)情況下的軸向定位精度;(b)不同背景噪聲的軸向定位精度;(c),(d),(e)不同位置處的x,y和z軸定位精度(藍(lán)色為光子數(shù)N=1000,紅色為光子數(shù)N=5000)

4 運(yùn)用誤差傳遞定律計(jì)算DH-PSF的三維質(zhì)心定位精度

DH-PSF的軸向質(zhì)心定位精度是由兩個(gè)旁瓣相對(duì)于軸向距離的旋轉(zhuǎn)角來確定的,根據(jù)其產(chǎn)生原理,可知旋轉(zhuǎn)角θ為[12]

c為在LG模式平面上所取點(diǎn)的斜率,z0為瑞利長度,ω0為束腰半徑.由數(shù)學(xué)知識(shí)我們可知,兩個(gè)點(diǎn)相對(duì)于水平方向的夾角為

把(18)式代入(16)式可得：

誤差傳遞函數(shù)定律為[13]

式中σ1(σ2,σ3,σ4)為x1(x2,y1,y2)的標(biāo)準(zhǔn)差,把(19)式代入(20)式則σz為DH-PSF的軸向定位精度.

下面,我們通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行DH-PSF定位精度的模擬,所有計(jì)算均在Matlab編程環(huán)境下實(shí)現(xiàn)[14].模擬參數(shù)如下：樣品尺度為12×12個(gè)像元,熒光波長λ=670 nm,物鏡放大倍率M=100,數(shù)值孔徑NA=1.4,探測器像元大小為16μm.如圖3(a)所示,源圖像的生成方法如下：首先,通過(1,1),(3,5),(5,9),(7,13),(9,17)五個(gè)LG模式疊加得到DH-PSF的圖像;然后,再加上泊松分布的光子散彈噪聲和高斯分布的背景噪聲,最終獲得用于定位的2000幅源圖像.模擬實(shí)驗(yàn)中,背景噪聲均值為2e-/pixel.

圖像重構(gòu)步驟如圖3(b)所示.首先,對(duì)上面的源圖像進(jìn)行濾波降噪;再把圖像分成兩個(gè)區(qū)域,分別求得兩個(gè)區(qū)域的最大值的坐標(biāo),并作為高斯擬合的初值,用高斯擬合質(zhì)心定位算法進(jìn)行定位,獲得4000個(gè)定位點(diǎn),求得這4000個(gè)定位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)差,代入(20)式即可求得其軸向的定位精度.

通過上面定位算法所求得的軸向質(zhì)心定位精度與前面計(jì)算CRB所得出的FI理論定位精度比較,如圖4所示,藍(lán)色為計(jì)算CRB所得出的FI理論定位精度,紅色為質(zhì)心定位算法所求定位精度.通過質(zhì)心定位算法求得的定位精度比FI理論定位精度低(誤差數(shù)值高),且在光子數(shù)比較少的情況下差距比較大,但在光子數(shù)比較多時(shí),兩個(gè)數(shù)值基本相同.

圖3 定位算法步驟原理圖 (a)源圖像的生成;(b)圖像的重構(gòu)

圖4 質(zhì)心定位算法(紅色)所求得的軸向定位精度與計(jì)算CRB(藍(lán)色)所得出的FI理論定位精度比較

5 總結(jié)與討論

通過對(duì)DH-PSFFI矩陣的計(jì)算,求得其CRB值,表示了它的FI理論三維定位精度.同樣,根據(jù)質(zhì)心定位算法也求出了其定位精度.兩者相比較可知,運(yùn)用質(zhì)心定位精度算法求出的定位精度要比直接運(yùn)用公式計(jì)算CRB所得的FI理論定位精度要低;但是,在光子數(shù)大于1000的條件下,二者的差別還是比較小的,基本上一致.由于在光子數(shù)少的情況下,信噪比較差,運(yùn)用高斯擬合質(zhì)心定位時(shí),造成對(duì)質(zhì)心位置的定位偏差過大,從而造成質(zhì)心定位精度算法求出的定位精度標(biāo)準(zhǔn)誤差增大,即定位精度降低;而在光子數(shù)多的情況下,噪聲對(duì)質(zhì)心位置定位的偏差較小,因此二者之間的定位精度基本一致.

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