梅和坤，王 睿，白 楠，梁蓓蓓，曹 江，汶 柯，唐銘婧，劉銀萍，李 悅，王 瑾（解放軍總醫(yī)院藥物臨床研究中心，北京 100853）

莫西沙星屬第四代新型氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，通過抑制細(xì)菌的DNA螺旋酶A亞單位和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的活性，阻斷DNA的復(fù)制，發(fā)揮殺菌作用。莫西沙星對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、厭氧菌及非典型病原體（支原體、衣原體、軍團(tuán)桿菌）均有良好的抗菌活性，具有組織滲透力強(qiáng)、生物利用度高、作用時(shí)間長、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。目前，血漿中莫西沙星濃度的測(cè)定主要采用紫外、熒光或質(zhì)譜法[3-11]，而紫外法存在靈敏度低、干擾大和選擇性差等問題，質(zhì)譜法[4,10]測(cè)定采用固相萃取技術(shù)，固相萃取操作繁瑣，成本高。本實(shí)驗(yàn)采用直接沉淀蛋白法，快速、靈敏、簡捷，為莫西沙星的臨床藥動(dòng)學(xué)、生物利用度研究及臨床患者的血藥濃度測(cè)定提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：Y0000703，European Pharmacopeaia，純度96.1%）；左氧氟沙星（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：130455-201005，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純。

空白血漿來自解放軍總醫(yī)院輸血科。

Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6410B型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；METTLER XS105型天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）；SIGMA-15PK型高速低溫離心機(jī)（德國SIGMA公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱為ZORBAX EP-C18柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，美國Agilent公司）；流動(dòng)相為甲醇-水（45∶55，v/v），其中水相中含0.05%甲酸；流速為0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為25 ℃。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子化源（ESI），正離子模式；毛細(xì)管電壓：4000 V；溫度：350 ℃；霧化器（N2）壓力：35 psi；干燥氣流速為10 L·min-1；掃描方式為多重反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；莫西沙星的離子對(duì)為m/z402.1→m/z384.3，毛細(xì)管出口電壓為120 V；碰撞能量：CE = 25 ev；左氧氟沙星的離子對(duì)為m/z362.4→m/z261.2，毛細(xì)管出口電壓為135 V；用于分析的離子碰撞能量：CE = 35 ev。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取莫西沙星標(biāo)準(zhǔn)品26.01 mg（純度為96.1%，含莫西沙星25 mg），置于25 mL容量瓶，以甲醇定容，配成1 mg·mL-1儲(chǔ)備液，避光、恒溫4 ℃保存。取該儲(chǔ)備液以甲醇依次倍比稀釋，配成莫西沙星濃度為50，100，250，500，2000，5000，10 000 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取左氧氟沙星對(duì)照品25.5 mg（純度為98%），置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，取該儲(chǔ)備液以甲醇倍比稀釋至1 μg·mL-1，作為內(nèi)標(biāo)工作溶液置于4 ℃冰箱保存待用。

1.5 血漿樣品處理方法

將樣品從-80 ℃冰箱取出，室溫下自然融化。精密吸取血漿樣品100 μL置于潔凈EP管中，依次加入1μg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液100 μL和甲醇溶液800 μL，渦旋混勻1 min后，在14 000 r·min-1下離心10 min，取上清液200 μL置于一潔凈EP管中，加入200 μL去離子水，渦旋混勻，取上清液進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜分析

莫西沙星和左氧氟沙星的子離子掃描圖見圖1和圖2。

2.2 方法的專屬性

圖1 莫西沙星的子離子掃描圖Fig 1 Product ion scan of moxifloxacin

圖2 左氧氟沙星的子離子掃描圖Fig 2 Product ion scan of levofloxacin

取6名不同健康人的空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)外，按照“血漿樣品處理方法”處理，得到典型圖譜A。取一定濃度的莫西沙星血漿溶液加入內(nèi)標(biāo)，按照“血漿樣品處理方法”處理，得到色譜圖B、C。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾莫西沙星和內(nèi)標(biāo)左氧氟沙星的測(cè)定。具體見圖3。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍

取空白血漿100 μL加入莫西沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成相當(dāng)于血漿濃度為50，100，250，500，2000，5000，10 000 ng·mL-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下操作，取10 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以莫西沙星濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比為橫坐標(biāo)，系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品測(cè)得的莫西沙星的峰面積與內(nèi)標(biāo)左氧氟沙星的峰面積比值為縱坐標(biāo)，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸[12]求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y= 2.614 6X+ 0.043 6（r= 0.996），線性范圍50 ～ 10 000 ng·mL-1。

2.4 定量下限

將50 ng·mL-1的莫西沙星待測(cè)物進(jìn)行6樣本分析，并根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得每一樣本的濃度，求得莫西沙星的濃度均值為（56.45±1.91） ng·mL-1，RSD為3.38%，準(zhǔn)確度為106.9% ～ 113.6%。結(jié)果表明，該方法下莫西沙星待測(cè)物濃度定量下限可達(dá)到50 ng·mL-1。

2.5 精密度和提取回收率

圖3 血漿中莫西沙星和內(nèi)標(biāo)左氧氟沙星的色譜圖

分別配制濃度為100，500，5000 ng·mL-1的血漿樣品作為質(zhì)控（QC）樣品，按血漿樣品處理方法項(xiàng)操作，每一濃度平行配制、測(cè)定6個(gè)樣本，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品濃度，計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度為90.04% ～109.79%，日內(nèi)精密度RSD ≤3.81%，日間精密度RSD ≤4.26%，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。具體見表1。

精密吸取空白血漿100 μL置于一潔凈EP管中，依次加入1 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液100 μL和甲醇溶液800 μL，渦旋混勻1 min后，再加入莫西沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，混勻，在14 000 r·min-1下離心10 min，取上清液200 μL置于一潔凈EP管中，加入200 μL去離子水，渦旋混勻，取上清進(jìn)樣分析。與當(dāng)日高、中、低三個(gè)濃度的QC樣本的峰面積比較，計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明，高、中、低三個(gè)濃度下藥物的提取回收率比較穩(wěn)定。具體見表2。

表2 基質(zhì)效應(yīng)對(duì)莫西沙星血藥濃度的影響. n = 9Tab 2 The matrix effect on the concentration of moxifloxacin in human serum. n = 9

2.6 樣品穩(wěn)定性

制備莫西沙星低、中、高三個(gè)濃度（100，500和5000 ng·mL-1）的血清樣品，分別在室溫放置4 h、-80℃反復(fù)凍融3次和處理后樣本自動(dòng)進(jìn)樣器放置24 h考察其穩(wěn)定性，結(jié)果表明樣品在上述條件下均穩(wěn)定（RE ＜9.61%）。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

精密吸取去離子水100 μL置于一潔凈EP管中，依次加入莫西沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，1 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液100 μL和甲醇溶液700 μL，渦旋混勻1 min后，再加入莫西沙星系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，在14 000 r·min-1下離心10 min，取上清液200 μL置于一潔凈EP管中，加入200 μL去離子水，渦旋混勻，取上清液進(jìn)樣分析，與當(dāng)日高、中、低三個(gè)濃度的QC樣本的峰面積比較。結(jié)果表明基質(zhì)效應(yīng)不影響藥物的測(cè)定。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-MS/MS法檢測(cè)人血漿中莫西沙星濃度的方法，特異性強(qiáng)，定量下限低，靈敏度高，并且本方法較以往的檢測(cè)方法有如下改進(jìn)：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)與檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)性能相適應(yīng)，線性良好，定量準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)過程中將定量上限提高到10 000 ng·mL-1，定量下限降至50 ng·mL-1，在實(shí)際應(yīng)用中能夠檢測(cè)到給藥后5個(gè)半衰期以上的藥物濃度，完全符合應(yīng)用中的定量需要，絕大多數(shù)藥物濃度均落在該線性范圍內(nèi)。（2）在對(duì)含藥血漿的前處理方面，高效液相法可以采用沉淀能力強(qiáng)的高氯酸、三氟乙酸等沉淀劑，而HPLC-MS/MS法往往不能使用此類沉淀劑，甲醇乙腈沉淀法對(duì)血漿的稀釋倍數(shù)較大，同時(shí)為了減小基質(zhì)效應(yīng)往往也需要加大稀釋倍數(shù)，這樣甲醇直接沉淀法就可能難以達(dá)到所要求的定量下限。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了血漿前處理方法，未采用以往文獻(xiàn)報(bào)道的液質(zhì)聯(lián)用法的固相萃取[4,10]，高效液相色譜法的液液萃取[13-14]和氮?dú)獯蹈煞╗11]，而采用甲醇直接沉淀法，改進(jìn)血漿處理方法后，減少了定量操作的步驟，使定量更準(zhǔn)確，血漿處理更方便，處理效率更高，提高實(shí)際測(cè)定樣品濃度的實(shí)用性。該方法可以高效、準(zhǔn)確的測(cè)定血漿中莫西沙星的濃度，適用于莫西沙星藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

表1 莫西沙星血漿濃度測(cè)定方法的精密度和提取回收率. n = 18Tab 1 Precision and recovery of moxifloxacin in human serum. n = 18

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