劉曉秋，付云云，徐佳佳，潘英妮，秦虹，王振中，蕭偉*

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001; 3.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001)

金振口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

劉曉秋1*，付云云1，徐佳佳1，潘英妮1，秦虹1，王振中2，3，蕭偉2，3*

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001; 3.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001)

目的：提高和完善金振口服液的薄層鑒別和含量測(cè)定方法。方法：改進(jìn)《中國(guó)藥典》(2010版)中金振口服液項(xiàng)下大黃、黃芩、人工牛黃和甘草薄層鑒別方法。采用HPLC同時(shí)測(cè)定處方中黃芩苷和甘草酸含量，用Waters C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫為室溫。結(jié)果：簡(jiǎn)化了供試液的制備方法，4種中藥的薄層鑒別共用1個(gè)供試品溶液，取樣量由120 mL降為10 mL。黃芩苷和甘草酸的質(zhì)量濃度分別在8.29～99.5 mg·L-1(r=0.999 7，n=5)和3.90～46.8 mg·L-1(r=0.999 2，n=5)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系；平均加樣回收率分別為97.6%和97.8%，RSD分別為2.4%和2.6%。結(jié)論：改進(jìn)后的薄層鑒別法簡(jiǎn)便、易于操作、節(jié)約實(shí)驗(yàn)樣品和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，含量測(cè)定方法科學(xué)準(zhǔn)確、重復(fù)性高，均可作為金振口服液的質(zhì)量控制方法。

金振口服液；薄層色譜鑒別；含量測(cè)定

金振口服液收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部，具有清熱解毒、祛痰止咳的功能，用于小兒痰熱咳嗽的急性支氣管炎[1]，其療效可靠、安全性好、依從性高，已列為我國(guó)兒童醫(yī)療保險(xiǎn)品種。金振口服液由羚羊角、平貝母、大黃、黃芩、青礞石、生石膏、人工牛黃、甘草8味藥組成，在治療[2]和輔助治療小兒支氣管炎[3]、抗病毒[4-5]和兒童手足口病[6]等方面具有良好的效果。《中國(guó)藥典》2010年版一部中采用薄層色譜法鑒別金振口服液中大黃、黃芩、人工牛黃和甘草4味中藥，分別制備了3種不同的供試品溶液，且采用熱回流、大孔吸附樹(shù)脂等提取手段，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，沒(méi)有體現(xiàn)出薄層色譜法簡(jiǎn)便易行、協(xié)同等優(yōu)勢(shì)；含量測(cè)定中采用HPLC僅測(cè)定了黃芩苷一個(gè)指標(biāo)成分的含量。筆者在前期對(duì)金振口服液的藥效及質(zhì)量控制相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，方中除黃芩外，甘草等成分與藥效也直接相關(guān)，甘草酸是甘草中的特異性成分，常作為甘草及其制劑的指標(biāo)成分，易于紫外檢測(cè)。筆者對(duì)供試液的制備方法、展開(kāi)系統(tǒng)、顯色方法等進(jìn)行了考察，簡(jiǎn)化了該制劑的TLC鑒別法；采用HPLC同時(shí)測(cè)定制劑中2種主要藥效成分黃芩苷和甘草酸的含量，為進(jìn)一步完善金振口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

LC-20AB高效液相色譜系統(tǒng)、SPD-20A紫外檢測(cè)器(日本Shimadzu公司)，DENVER INSTRUMENT TB-25分析天平(北京丹佛儀器有限公司)。

硅膠G板(自制，薄層色譜用硅膠G，青島海洋化工有限公司)；金振口服液(批號(hào)：110608，110609，110610，110611，110612，110613，120203，120306，120214)及處方中的各味中藥由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供；豬去氧膽酸對(duì)照品(批號(hào)：0087-9708)、膽酸對(duì)照品(批號(hào)：0078-9312)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：715-200010)、甘草次酸對(duì)照品(批號(hào)：723-200109)、甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào)：110731-200615)、大黃對(duì)照藥材(批號(hào)：121249-200402)、甘草對(duì)照藥材(批號(hào)：120904-200512)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，所用試劑均為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備 取金振口服液10 mL，加鹽酸1 mL，搖勻，加乙酸乙酯50 mL，超聲10 min，分離乙酸乙酯層，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 大黃的鑒別 取大黃對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇15 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加鹽酸1 mL及二氯甲烷15 mL，加熱回流1 h，分取二氯甲烷液，水溶液用二氯甲烷振搖提取3次，每次10 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)佣燃淄? mL使溶解，作為大黃對(duì)照藥材溶液。另取大黃陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取大黃對(duì)照藥材溶液5 μL，供試品溶液10 μL，大黃陰性對(duì)照液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶8∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視，結(jié)果如圖1。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)；置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，顯相同的紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.3黃芩的鑒別 取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為黃芩苷對(duì)照品溶液。另取黃芩陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取黃芩苷對(duì)照品溶液 5 μL，供試品溶液及黃芩陰性對(duì)照液各2 μL，分別點(diǎn)于同一含有4%醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液[7]，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果如圖2。供試品色譜中，在與黃芩苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.4 人工牛黃的鑒別 取膽酸對(duì)照品、豬去氧膽酸對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，分別作為膽酸對(duì)照品和豬去氧膽酸對(duì)照品。另取人工牛黃陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取膽酸對(duì)照品溶液、豬去氧膽酸對(duì)照品溶液5 μL，供試品溶液及人工牛黃陰性對(duì)照液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸-甲醇(3∶6∶0.5∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果如圖3。供試品色譜中，在與膽酸對(duì)照品和豬去氧膽酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.5 甘草的鑒別 取甘草對(duì)照藥材1 g，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，棄去濾液，藥渣加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為甘草對(duì)照藥材溶液。另取甘草次酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為甘草次酸對(duì)照品溶液。另取甘草陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取甘草對(duì)照藥材溶液5 μL，供試品溶液及甘草陰性對(duì)照液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，石油醚-正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶15∶7∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干噴以2%硫酸乙醇溶液[8]，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果如圖4。供試品色譜中，在與甘草對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)和相同的橙黃色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品10.0 mg，甘草酸銨對(duì)照品5.0 mg，分別置25 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得黃芩苷對(duì)照品貯備溶液和甘草酸銨對(duì)照品貯備溶液。分別精密吸取上述各貯備溶液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，得混合對(duì)照品貯備溶液。精密吸取混合對(duì)照品貯備溶液0.5，1，2，4，6 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得各濃度混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取金振口服液1 mL，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例分別稱(chēng)取除黃芩、除甘草、除黃芩和甘草以外的其余中藥，按金振口服液的制備工藝分別制備缺黃芩、缺甘草、缺黃芩和甘草的陰性樣品。按2.2.2項(xiàng)方法操作，分別制成缺黃芩、缺甘草、缺黃芩和甘草的陰性對(duì)照溶液。

1.大黃對(duì)照藥材2.金振口服液3.大黃陰性對(duì)照液圖1 金振口服液中大黃TLC鑒別

1.黃芩苷對(duì)照品2.金振口服液3.黃芩陰性對(duì)照液圖2 金振口服液中黃芩TLC鑒別

1.膽酸對(duì)照品 2.豬去氧膽酸對(duì)照品3.金振口服液4.人工牛黃陰性對(duì)照液圖3 金振口服液中人工牛黃TLC鑒別

1.甘草對(duì)照藥材2.甘草次酸對(duì)照品3.金振口服液4.甘草陰性對(duì)照液圖4 甘草TLC鑒別

2.2.4色譜條件 色譜柱：Waters C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)；梯度洗脫程序：0～5 min：29%A；5～12 min：29%～47%A；12～17 min：47%～50%A；17～20 min：50%A；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 取2.2.1項(xiàng)各濃度混合對(duì)照品溶液，按2.2.4項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，mg·L-1)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，黃芩苷和甘草酸回歸方程分別為Y=2.674×104X-2.594×104(r=0.999 7)，Y=1.939×104X+1.280×104(r=0.999 2)。表明黃芩苷質(zhì)量濃度在8.29～99.5 mg·L-1，甘草酸質(zhì)量濃度在3.90～46.8 mg·L-1(相當(dāng)于甘草酸銨質(zhì)量濃度3.98～47.8 mg·L-1)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)陰性對(duì)照溶液，在2.2.4色譜條件下進(jìn)樣，觀察被測(cè)組分峰保留時(shí)間處是否有其他組分峰干擾。結(jié)果表明被測(cè)組分峰保留時(shí)間處無(wú)其他組分峰干擾，即陰性對(duì)照溶液對(duì)供試品測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖5。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按2.2.4項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃芩苷和甘草酸的峰面積，計(jì)算RSD分別為1.7%，1.2%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取金振口服液(批號(hào)：110608)按2.2.2項(xiàng)制備供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h按2.2.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定黃芩苷和甘草酸的峰面積，計(jì)算RSD分別為2.0%，1.8%。表明金振口服液供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取金振口服液(批號(hào)：110608)按2.2.2項(xiàng)平行制備供試品溶液6份，按2.2.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算黃芩苷和甘草酸含量的RSD分別為1.6%和1.9%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的金振口服液供試品(批號(hào)：110608)9份，每份0.5 mL，分別置25 mL量瓶中，分別加黃芩苷和甘草酸對(duì)照品貯備溶液適量，按2.2.2項(xiàng)操作，按2.2.4色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 金振口服液中黃芩苷和甘草酸的回收率試驗(yàn)

1.黃芩苷 2.甘草酸A.混合對(duì)照品 B.供試品 C.缺黃芩和甘草的陰性對(duì)照品 D.缺黃芩的陰性對(duì)照品 E.缺甘草的陰性對(duì)照品圖5 金振口服液及對(duì)照品HPLC圖

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取9批樣品，按2.2.2項(xiàng)制備供試品溶液。按2.2.4色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中黃芩苷和甘草酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 金振口服液中黃芩苷和甘草酸的含量測(cè)定 /mg·L-1

3 討論

3.1 TLC鑒別供試液制備方法的簡(jiǎn)化

《中國(guó)藥典》2010版金振口服液項(xiàng)下大黃、黃芩、人工牛黃和甘草的薄層鑒別合計(jì)取樣量為120 mL，共制備了3個(gè)供試品溶液，本研究取樣量?jī)H需10 mL，用1個(gè)供試品溶液，取樣量明顯減少，不僅節(jié)約樣品，并且減化了繁瑣的供試液制備過(guò)程，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。文獻(xiàn)報(bào)道[9-11]人工牛黃、甘草、黃芩以及大黃主要藥效成分分別為甾體膽酸類(lèi)、三萜類(lèi)和黃酮類(lèi)以及蒽醌類(lèi)，均具有一定的酸性，因此在制劑萃取過(guò)程加入鹽酸可有效提高藥效成分提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙酸乙酯有利于黃芩、大黃、甘草、人工牛黃藥效物質(zhì)的提取，故可同時(shí)用于大黃等4種中藥薄層鑒別的供試品溶液制備。

3.2 TLC鑒別色譜條件的優(yōu)選

實(shí)驗(yàn)展開(kāi)系統(tǒng)替換了《中國(guó)藥典》中黃芩、人工牛黃和甘草薄層鑒別項(xiàng)中有毒溶劑甲苯和三氯甲烷，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員身體和環(huán)境的危害。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人工牛黃和甘草的薄層色譜采用硫酸乙醇顯色斑點(diǎn)清晰，與《中國(guó)藥典》方法相比，實(shí)驗(yàn)方法顯色方便，且色譜斑點(diǎn)集中，分布均勻，Rf值更好。

3.3 含量測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

由黃芩苷和甘草酸紫外全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，甘草酸在250 nm有最大吸收，黃芩苷在280，320 nm附近有較大吸收，其相應(yīng)信號(hào)要比甘草酸的響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)，通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器，檢查在280，250 nm計(jì)算黃芩苷對(duì)含量沒(méi)有顯著差異。為了提高對(duì)甘草酸的檢測(cè)靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選擇250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，該波長(zhǎng)下樣品中黃芩苷和甘草酸均可被檢出，且分離度良好。

3.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

9批樣品含量測(cè)定結(jié)果顯示，金振口服液中黃芩苷的含量在0.55 mg·mL-1以上，符合《中國(guó)藥典》規(guī)定(含量不少于0.25 mg·mL-1)。各批制劑中均可明顯檢測(cè)出甘草酸的色譜峰，其含量較高且穩(wěn)定，均在0.24 mg·mL-1以上，建議《中國(guó)藥典》2015年版增加甘草的含量測(cè)定，以提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.5不同批次樣品中的含量差異

不同批次樣品中黃芩苷和甘草酸的含量存在一定差異，應(yīng)密切關(guān)注生產(chǎn)過(guò)程中中藥來(lái)源、提取轉(zhuǎn)移率、中間體的穩(wěn)定性及制劑成型性等，以確保金振口服液質(zhì)量的穩(wěn)定可靠。

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StudiesonQualityStandardofJinzhenOralLiquid

LIU Xiao-qiu1*，F(xiàn)U Yun-yun1，XU Jia-jia1，PAN Ying-ni1，QIN Hong1，WANG Zhen-zhong2，3，XIAO Wei2，3*

(1.ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China；2.JiangsukangyuanPharmaceuticalCompanyLimited，Lianyungang222001，China；3.StateKeyLaboratoryofNew-techforChineseMedicinePharmaceuticalProcess，Lianyungang222001，China)

Objective：To Improve TLC identification and determination for Jinzhen oral liquid.Methods：Improve the TLC identification of Rhei Radix Et Rhizoma，Scutellariae Radix，Bovis Calculus Artifactus and Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma for Jinzhen oral liquid in Edition 2010 of Chinese Pharmacopoeia.The contents of baicalin and glycyrrhizic acid were determined simultaneously by HPLC.The HPLC was conducted on Waters C18column at room temperature.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.1% formic acid solution with gradient elution，the flow is 0.8 mL·min-1，wavelength is 250 nm.Results：The four test solution of the of Rhei Radix Et Rhizoma，Scutellariae Radix，Bovis Calculus Artifactus and Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma were simplified into one.The sampling volume was reduced from 120 mL to 10 mL.The linear ranges were 8.29-99.5 mg·L-1for baicalin(r=0.999 7，n=5)and 3.90-46.8 mg·L-1for glycyrrhizic acid(r=0.999 2，n=5)，respectively.The average recoveries rates were 97.6 % with RSD 2.4% for baicalin and 97.8% with RSD 2.6% for glycyrrhizic acid.Conclusion：The improved TLC identification method is simple，could save samples and time.The content determination is scientific，accurate，with high repeatability and could be used for the quality control of Jinzhen oral liquid.

Jinzhen oral liquid；TLC identification；Baicalin；Glycirrizic acid；Determination

2013-04-16)

中藥制劑過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金課題(SKL2010M0202)

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劉曉秋，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究和新藥研究，Tel：(024)23986469，E-mail：liuxiaoqiu3388@163.com；蕭偉，研究員及高級(jí)工程師，從事中藥新藥劑型的研究與開(kāi)發(fā)，E-mail：wzhzh-nj@tom.com