楊宗學(xué)，林楠，藺海明*，張巨瓊

(1.甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070)

基于HPLC對不同產(chǎn)地枸杞子中甜菜堿含量的研究△

楊宗學(xué)1，林楠2，藺海明2*，張巨瓊2

(1.甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)科技服務(wù)中心，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070)

目的：比較不同枸杞子中甜菜堿的含量并評價永登縣上川鎮(zhèn)產(chǎn)的枸杞質(zhì)量。方法：采用HPLC對9個不同樣品枸杞進(jìn)行甜菜堿含量測定。采用NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),流動相為乙腈-水(95∶0.5)、流速為0.6 mL·min-1、檢測波長為230 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：永登縣上川鎮(zhèn)產(chǎn)的枸杞子中甜菜堿含量為0.432 5%，處較高水平。結(jié)論：HPLC測定甜菜堿含量準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好；永登縣上川鎮(zhèn)所產(chǎn)枸杞子中甜菜堿含量高，在該地區(qū)培育出優(yōu)質(zhì)枸杞是可行的。

HPLC；不同產(chǎn)地；枸杞；甜菜堿；含量

枸杞LyciumbarbarumL.是茄科枸杞屬灌木植物，富含的多糖、氨基酸及生物堿等多種成分使其具有豐富的藥理作用。甜菜堿(betaine)作為枸杞中的一種重要成分，在體內(nèi)起甲基供應(yīng)體的作用，可以抗脂肪肝[1-2]。前人已有很多關(guān)于枸杞子甜菜堿的研究，其中有研究認(rèn)為NH2柱未經(jīng)衍生高效液相色譜法所測甜菜堿含量明顯高于分光光度法[3]；亦有研究認(rèn)為HPLC測定枸杞子甜菜堿含量靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為枸杞子中甜菜堿的定量測定方法[4]；同時有人在對枸杞的高效液相色譜指紋圖譜的研究中指出用于枸杞質(zhì)量控制的液相色譜指紋圖譜對提取方法具有很強(qiáng)的依賴性，用枸杞甜菜堿提取液的液相色譜指紋圖譜對品種進(jìn)行識別效果較好[5]；另外還有一些研究提出了其他多種甜菜堿的提取和含量測定方法[6-10]，這些研究對枸杞子中甜菜堿的提取及含量測定有著重要意義。但目前尚無以應(yīng)用日益廣泛、測定結(jié)果較準(zhǔn)確的HPLC對跨省區(qū)、多品種的枸杞子進(jìn)行甜菜堿含量的測定和比較。作者以甘肅省永登縣上川鎮(zhèn)生產(chǎn)的枸杞子為主體，通過HPLC對不同產(chǎn)地、不同品種枸杞子的甜菜堿含量進(jìn)行測定并對比，以期為進(jìn)一步完善HPLC測定甜菜堿的色譜分析條件提供參考，同時對甘肅省永登縣秦王川地區(qū)枸杞的栽培和品質(zhì)的評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究用的材料均為2011年8月分別采自寧夏農(nóng)科院枸杞觀光園、寧夏中寧縣舟塔鄉(xiāng)、寧夏平羅縣頭閘鎮(zhèn)、甘肅景泰縣草窩灘鄉(xiāng)、甘肅靖遠(yuǎn)縣東升鄉(xiāng)、甘肅省玉門市玉門鎮(zhèn)、甘肅景泰縣草窩灘鄉(xiāng)、青海省諾木洪農(nóng)場和甘肅永登縣上川鎮(zhèn)的同一批次枸杞子。其中寧夏3份，甘肅5份，青海1份，品種除甘肅景泰縣草窩灘鄉(xiāng)的為“蒙杞1號”、青海省諾木洪農(nóng)場的為“柴杞”外，其余7份均為“寧杞1號”。

1.2 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀，島津SPD-M20A二極陣列管檢測器，LC-solution色譜工作站，NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，PL303-IC梅特勒電子天平，恒溫水浴鍋，無水甲醇，超純水，乙腈。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備[11]

精密稱取枸杞子粉末2.000 g，加入無水甲醇50 mL，80 ℃回流提取1 h，放至室溫，過濾，用30 mL甲醇分次洗滌濾渣和濾器，合并濾液，40 ℃下減壓濃縮，水溶解定容至10 mL，備用。在色譜分析前，過0.45 μm微孔濾膜，并根據(jù)需要做濃度處理。

2.2 對照品溶液的制備

取甜菜堿對照品適量，精密稱定，水溶解定容，得到濃度為0.12 mg·mL-1的溶液，備用。

2.3 線性關(guān)系考察

分別取對照品溶液2.5,5,7.5,10,12.5,15 μL注入色譜儀，按實驗條件進(jìn)行色譜分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得線性方程Y=136 914X+8 786.3，r=0.999 4，表明進(jìn)樣量在0.3～1.8 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取濃度為0.12 mg·mL-1的對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行色譜分析，測定峰面積，結(jié)果RSD=0.80%，表明精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 分別取1號樣品供試液10 μL，于0,2,6,12,24 h后進(jìn)樣，測定峰面積，結(jié)果RSD=0.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重現(xiàn)性試驗 取1號枸杞子樣品，制備5分供試液，分別取10 μL進(jìn)樣，測定峰面積，結(jié)果RSD=1.29%，表明該法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 回收率試驗 取已知甜菜堿含量的供試液，加適量的對照品溶液，取10 μL進(jìn)樣(n=6)，測定峰面積并計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.45%，RSD%=2.32%。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件及典型色譜圖

圖1 甜菜堿對照品和枸杞子供試樣品HPLC圖

通過試驗對波長、流速、流動相的配比等進(jìn)行摸索，最終確定在NH2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、乙腈-水(95∶0.5)、流速0.6 mL·min-1、檢測波長230 nm、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量10 μL的條件下色譜分析效果良好。對照品及樣品甜菜堿色譜圖如圖1所示。樣品的色譜圖中，甜菜堿峰型明顯，在5 min左右出現(xiàn)，其中1號樣品為甘肅省永登縣甘露池村所產(chǎn)枸杞子，甜菜堿峰面積分值為317 079，3號樣品即寧夏中寧縣舟塔鄉(xiāng)枸杞子樣品的峰面積分值最高，為425 750；各樣品間色譜圖呈現(xiàn)出不同程度的差異，產(chǎn)地不同的同品種枸杞子1號和3號、6號和7號色譜峰特征性分別相似(如圖1中B、D、G、H所示)，而2號、4號、5號則各有特點，差異較大；不同品種枸杞子的色譜峰亦有差異，8號、9號色譜峰與其他樣品均呈現(xiàn)較大差異(如圖1中I、J所示)，證明樣品色譜圖的相似度由產(chǎn)地條件和樣品品種共同決定，不同樣品其化學(xué)成分含量有差異。

3.2 不同枸杞子甜菜堿含量的比較

通過對9個樣品的甜菜堿峰面積進(jìn)行測定，進(jìn)而計算出各樣品甜菜堿含量，最高為0.588 0%，最低為0.300 4%，均大于0.300 0%，達(dá)到《中國藥典》2010版規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)；對9個樣品含量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，不同枸杞子甜菜堿含量存在差異,見表1。

表1 不同產(chǎn)地枸杞子甜菜堿含量比較

注：不同小寫字母表示該指標(biāo)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05

由表1可以看出，甘肅永登縣上川鎮(zhèn)所產(chǎn)枸杞子的甜菜堿含量為0.432 5%，在所有供試樣品中列第3位，處于較高水平；對不同產(chǎn)地的枸杞子樣品進(jìn)行品種內(nèi)對比后發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的同一品種枸杞子，甜菜堿含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中寧夏所產(chǎn)枸杞子除平羅縣頭閘鎮(zhèn)樣品外，甜菜堿含量均較高，整體處于優(yōu)勢地位，其中就包括最高的中寧縣舟塔鄉(xiāng)所產(chǎn)枸杞子，甜菜堿含量為0.588 0%；此外對不同品種的枸杞子進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，品種不同甜菜堿含量差異明顯，其中甘肅景泰縣草窩灘鄉(xiāng)所產(chǎn)“蒙杞1號”枸杞子，甜菜堿含量為0.404 5%，處于中等偏上水平，而青海諾木洪農(nóng)場的“柴杞”則含量較低。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)論

供試樣品枸杞子的色譜圖呈現(xiàn)不同程度的差異，同品種枸杞子中亦有較多色譜圖相似度較差，證明產(chǎn)地條件對枸杞子甜菜堿色譜圖的特征性有影響。

9個不同枸杞子樣品中甜菜堿含量有明顯差異，其中同品種“寧杞1號”枸杞甜菜堿含量從0.300 4%到0.588 0%不等，而部分“寧杞1號”枸杞子與“蒙杞1號”、“柴杞”甜菜堿含量差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義，證明同一枸杞子品種產(chǎn)地不同其甜菜堿含量有差異、不同枸杞子品種間甜菜堿含量也存在不同程度的差異，產(chǎn)地條件與品種因素對甜菜堿含量都有影響，這與前人部分研究結(jié)論一致[13]。

4.2 討論

在進(jìn)行高效液相色譜測定時，曾選用C18色譜柱[12]，但效果較差，分析其原因可能是由于甜菜堿為季胺型水溶性生物堿，極性較大所致，故選擇NH2色譜柱，結(jié)果分離效果良好；實驗中還分別在檢測波長195，210，230 nm下進(jìn)行色譜分析，結(jié)果在230 nm下各組分色譜峰均有較大吸收。

實驗進(jìn)一步肯定了HPLC在測定枸杞子甜菜堿含量方面準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)勢[3-4,14]；研究主體甘肅永登縣上川鎮(zhèn)所產(chǎn)枸杞子的甜菜堿含量在9個樣品中處第3位，就甜菜堿這一藥用成分而言品質(zhì)較優(yōu)，這一結(jié)果有助于日后在甘肅省秦王川地區(qū)繼續(xù)開展枸杞的栽培與選育工作。

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StudyonDeterminationofBetaineinLyciiFructusfromDifferentHabitatsbyHPLC

YANG Zong-xue1,LIN Nan2，LIN Hai-ming2*,ZHANG Ju-qiong2

(1.ServiceCenterofAgriculturalScienceandTechnologyofYongdengCounty,Lanzhou730030，China； 2.GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070，China)

Objective： To compare the betaine content in Lycii Fructus from different habitats and evaluate the quality ofLyciumbarbarumfrom Shangchuan town,Yongdeng county.Methods： Use HPLC to determine betaine content of 9 different samples. NH2(250 mm×4.6 mm，5 μm) chromatographic column,acetonitrile： water (95∶0.5),the flow rate was 0.6 mL·min-1,the detective wavelength was 230 nm,the temperature was 30 ℃ and the injection volume was 10 μL.Results： The betaine content in Lycii Fructus from Shangchuan town is 0.432 5%,this is a high level.Conclusion： The HPLC method is precise and reproducible,betaine content in Lycii Fructus from Shangchuan town is high,it is possible to yield good quality ofLyciumbarbarumat Shangchuan town.

HPLC ； Habitat； Lycii Fructus； Betaine

2012-11-04)

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蘭州市科技計劃項目(2010-1-236)

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藺海明，E-mail：linhm@gsau.edu.cn