司海燕，程曉明，孔凡立，曾 峰，李哲遠(yuǎn)，楊 華，劉華慶

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.甲乳外科；2.病理科，貴州遵義 563003）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）的發(fā)病率已經(jīng)超過了總體甲狀腺癌的年均增長幅度［1］。PTC占甲狀腺癌病理類型的60%～70%，大多發(fā)展緩慢并且預(yù)后良好［2］，十年的生存率在95%以上［3］，但也有部分PTC很快出現(xiàn)局部侵犯并發(fā)生轉(zhuǎn)移。Chen等［4］報(bào)道，PTC中的柱狀細(xì)胞變型，部分生物學(xué)行為會表現(xiàn)出差分化和未分化癌的惡性程度高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的特性。腫瘤直徑小于或等于1.0cm的甲狀腺微小癌早期也極易發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［5］。因此，研究PTC的發(fā)病機(jī)制，通過特征性腫瘤標(biāo)志物評估患者的預(yù)后和識別腫瘤的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，在PTC的治療中尤為重要。

甲狀腺癌女性發(fā)病率為男性的3倍，在青春期后、絕經(jīng)期前雌激素分泌旺盛時(shí)期這種性別差異尤為明顯，盡管機(jī)制尚未證實(shí)，但有學(xué)者推測雌激素在PTC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［6］。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）是細(xì)胞周期蛋白家族的重要成員，細(xì)胞周期核心調(diào)控因子的異?？赡軐?dǎo)致細(xì)胞周期G1期縮短，造成細(xì)胞周期調(diào)控失常和細(xì)胞異常增殖而形成腫瘤。本文通過研究PTC中雌激素受體a亞型（ERa）和cyclinD1的表達(dá)，探討兩者在PTC中表達(dá)的意義，為PTC的治療及判斷預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科2005年1月至2011年3月經(jīng)病理確診為PTC 48例，男8例，女40例；年齡10～73歲，平均42.2歲，大于或等于45歲11例，小于45歲37例；有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（頸清標(biāo)本病理證實(shí)）28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例；甲狀腺癌原發(fā)灶腫瘤有包膜侵犯（以術(shù)中所見及病理證實(shí)為依據(jù)）31例，無包膜侵犯者17例，患者術(shù)前未行放射、化學(xué)治療。同期設(shè)甲狀腺良性病變旁正常甲狀腺組織30例、甲狀腺良性病變69例（甲狀腺濾泡性腺瘤28例，慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎6例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫34例，甲狀腺嗜酸細(xì)胞瘤1例）。用已知ERa、cyclinD1表達(dá)的乳腺癌組織作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 兔抗人ERa單克隆抗體、兔抗人cyclinD1單克隆抗體、Envision檢測試劑盒均購自上?；蚬?。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法 采用Envision免疫組化法測定cyclinD1和ERa。實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）石蠟切片4μm，常規(guī)脫蠟至水洗；（2）3%H2O210min，水洗；（3）pH6.0的檸檬酸鹽高壓修復(fù)，冷卻后PBS沖洗3次×5min；（4）加一抗，4℃過夜，PBS沖洗3次×5min；（5）加Envision二抗37℃30min，PBS沖洗3次×5min；（6）DAB顯色，水洗；（7）蘇木精對比染色，脫水，透明，封固。

1.3 結(jié)果評定 ERa和cyclinD1陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞核。免疫組化結(jié)果判定是根據(jù)陽性細(xì)胞比例，見參考文獻(xiàn)［7］，400倍顯微鏡下任意5個(gè)高倍鏡視野里陽性細(xì)胞數(shù)小于5%為陰性，5%～15%為＋，＞15%～40%為＋＋，＞40%～60%為＋＋＋，＞60%為＋＋＋＋。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對各數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ERa、cyclinD1在各組中的表達(dá) ERa在各組中均有表達(dá)，表達(dá)主要定位細(xì)胞核，為棕黃色顆粒，在PTC中的表達(dá)見圖1A。由表1可見，在PTC中ERa的陽性率為25%（12／48）高于正常甲狀腺組織6.7%（2／30）和甲狀腺良性病變10.1%（7／69）的陽性率（P＜0.05）。cyclinD1在正常甲狀腺組織中無表達(dá)，在PTC中79.2%（38／48）的陽性率明顯高于甲狀腺良性病變中27.5%（19／69）的陽性率（P＜0.05），cyclinD1在PTC中的表達(dá)見圖1B。

表1 cyclinD1、ERa在正常甲狀腺、甲狀腺良性病變、甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)

圖1 ERa、cyclinD1在PTC中的陽性表達(dá)（ICH×400）

表3 ERa、cyclinD1在PTC中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 ERa、cyclinD1與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系 PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的cyclinD1陽性率92.9%（26／28）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組60%（P＜0.05），PTC腫瘤包膜有侵犯的cyclinD1陽性率90.3%（28／31）顯著高于無腫瘤包膜侵犯58.8%（P＜0.05）。ERa表達(dá)與PTC患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤包膜有無侵犯等臨床病理資料間的關(guān)系差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

3.1 雌激素在PTC中的作用 PTC女性患者發(fā)病率明顯高于男性。本組病例中女性患者人數(shù)為男性的5倍，同甲狀腺癌的流行病學(xué)特征相符。本研究表明ERa的表達(dá)在正常甲狀腺組織、甲狀腺良性病變、PTC中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，推測雌激素可能通過受體作用于PTC細(xì)胞，雌激素在PTC的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。Rajoria等［8］在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雌激素可以促進(jìn)PTC的BCPAP細(xì)胞株和正常甲狀腺Nthy-ori 3-1細(xì)胞株生長，雌激素能夠通過β連鎖蛋白（β-catenin）增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞的粘連、侵襲和轉(zhuǎn)移。本組PTC中ERa陽性率為25%，與Tavangar等［9］研究ER在PTC中31%的表達(dá)率較接近并同其ER的表達(dá)與PTC患者的年齡、性別、腫瘤侵犯包膜和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況無關(guān)的結(jié)果一致。與張璐等［10］報(bào)道ER表達(dá)與PTC患者性別、腫瘤是否浸潤包膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無關(guān)結(jié)論相一致，但與患者年齡呈反比的觀點(diǎn)有差異。

雌激素有兩條途徑發(fā)揮作用。（1）經(jīng)典的基因型效應(yīng)，雌二醇與胞內(nèi)ER結(jié)合后入細(xì)胞核，在核內(nèi)與靶基因的雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element，ERE）結(jié)合后激活其轉(zhuǎn)錄。雌激素的代謝產(chǎn)物β-雌二醇可以加快G1期向S期的轉(zhuǎn)化而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞生長，該作用可被雌激素拮抗劑三苯氧胺所抑制［11］。（2）途徑是非基因型效應(yīng)，雌二醇與其膜性受體結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的第2信使系統(tǒng)從而引起相應(yīng)的生理效應(yīng)。GPR30是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型雌激素膜性受體。Wang等［12］研究證實(shí)GPR30蛋白通過有絲分裂原活化蛋白激酶信號傳導(dǎo)通路（mitogen-activated protein kinase，MAPK）促進(jìn)雌激素相關(guān)腫瘤生長。氟維斯群（fulvestrant）是一種新型的ER拮抗劑，可以拮抗、阻斷、下調(diào)ER，但無ER激動作用，體外實(shí)驗(yàn)中觀察到雌激素能刺激甲狀腺癌細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲，雌激素與甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，而氟維斯群能直接抑制雌激素的這種作用，有可能為氟維斯群治療甲狀腺癌提供一定的理論依據(jù)［8］。

3.2 cyclinD1在PTC中的作用 本研究結(jié)果顯示，cyclinD1在正常甲狀腺組織中無表達(dá)，在PTC中的表達(dá)（79.2%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在甲狀腺良性病變中的表達(dá)（27.5%），表明cyclinD1蛋白與PTC的發(fā)生有關(guān)。cyclinD1的高表達(dá)存在于多種惡性腫瘤組織，提示患者預(yù)后欠佳［13］。細(xì)胞周期由細(xì)胞周期依賴性激酶（cyclin-independent kinase，CDK）控制，cyclinD1是細(xì)胞周期的正向調(diào)節(jié)因子，位于染色體11q23，它對CDK4和CDK6組成的核蛋白進(jìn)行編碼，使之磷酸化和失活視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤蛋白而發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)化，加速細(xì)胞細(xì)胞周期過程，使細(xì)胞無限制增殖［14］，因此cyclinD1的表達(dá)變化不僅與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，而且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。Jung等［15］研究發(fā)現(xiàn)PTC中cyclinD1的檢測有助于識別腫瘤的多灶性和判斷甲狀腺體內(nèi)的局部擴(kuò)散，并且cyclinD1的表達(dá)提示腫瘤具有潛在轉(zhuǎn)移的能力。楊曉文等［16］報(bào)道，cyclinD1在伴有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和原發(fā)灶有包膜侵犯的病例中的陽性表達(dá)率分別為92.6%和90.3%，明顯高于無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 （61.9%）和無包膜侵犯組（58.8%），與本研究結(jié)果一致，同樣說明cyclinD1的過表達(dá)可能提示PTC患者高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后。Li等［17］通過建立穩(wěn)定表達(dá)cyclinD1反義核酸的肺腺癌A549，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染cyclinD1反義核酸后，A549細(xì)胞凋亡增加，增殖顯著被抑制，機(jī)制可能是與pRb、E2F-1、VEGF、MMP-2和MMP-9的表達(dá)降低有關(guān)。對cyclinD1蛋白的表達(dá)抑制有可能會成為癌癥治療新的途徑。

通過本研究，作者認(rèn)為cyclinD1和ERa表達(dá)水平的檢測對于PTC診斷具有一定意義。cyclinD1的過表達(dá)提示腫瘤的高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移傾向，cyclinD1可以作為獨(dú)立因子評估PTC轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。對于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的晚期PTC，針對雌激素受體的抗雌激素治療有可能發(fā)揮獨(dú)特的作用。若能對PTC中ERa和cyclinD1進(jìn)行進(jìn)一步研究，則有可能為臨床上甲狀腺癌的診斷與治療提供更多可靠依據(jù)。

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