陳 盛，何念?！?，羅則佳

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院兒科，重慶 400038；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，成都 610083）

內(nèi)毒素（endotoxin，ET）是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，又稱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。LPS血癥是嚴重創(chuàng)傷、感染、肝病以及眾多危重疾病的常見并發(fā)癥，它不僅可導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS），嚴重者可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）。肝臟是清除LPS的主要器官，也是LPS血癥時受損最早、最明顯的器官之一，兩者之間存在互為因果、相互影響的關(guān)系，一旦發(fā)生容易形成惡性循環(huán)［1］。本文建立了LPS誘導(dǎo)D-半乳糖胺（D-GalN）致敏大鼠急性肝損傷動物模型，動態(tài)觀察了肝損傷后大鼠肝臟病理、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）的變化，以探討其在LPS急性肝損傷發(fā)生、發(fā)展中的規(guī)律及臨床意義，為尋求新的預(yù)防及治療方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，雌雄不限，10～12周齡，體質(zhì)量180～220g在清潔級環(huán)境中適應(yīng)1周后進入實驗，實驗前12h禁食，不禁水，實驗后即正常進食、進水。

1.1.2 主要試劑及材料 D-GalN購自重慶醫(yī)科大學(xué)生化室，LPS購自美國Sigma公司，Dab顯色試劑盒購自北京中山生物科技有限公司，原位末端標記法（TUNEL）凋亡檢測試劑盒購自美國Roche公司，大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自武漢博士德公司，大鼠IL-1βELISA試劑盒購自北京北方偉業(yè)發(fā)展有限公司，光學(xué)顯微鏡（LEICA BF200型）德國萊卡公司產(chǎn)品，全自動生化分析儀（H-7110）日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 LPS誘導(dǎo)D-GalN致敏大鼠急性肝損傷動物模型的建立［2］。48只大鼠隨機分為模型組和對照組，每組各24只。所有模型組大鼠均以LPS（50μg／kg）＋D-GalN（300mg／kg）用1 mL無菌生理鹽水溶解后腹腔內(nèi)注射，對照組大鼠僅腹腔內(nèi)注射1mL生理鹽水。

1.2.2 標本收集 每組分別在注射后6、24、48h3個時間點隨機抽取8只大鼠，麻醉處死大鼠后取肝組織備送光鏡及TUNEL分析、采血查 ALT、AST、TBIL、TNF-α、IL-1β等。

1.2.3 光鏡觀察肝組織的病理變化 取右葉同一部位肝組織，置10%甲醛磷酸鹽緩沖液固定后，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察病理變化。

1.2.4 血清ALT、AST、TBIL水平檢測 腹腔注射后6、24、48h時取對照組、模型組血液，4℃全能型高速冷凍離心機（3 000r／min）離心5min取上層血清。全自動生化析儀檢測ALT、AST、TBIL水平。

1.2.5 肝細胞的凋亡檢測 采用TUNEL檢測，肝組織經(jīng)多聚甲醛固定后，進行石蠟包埋、切片，切片常規(guī)脫蠟、水化后按照TUNEL試劑盒操作說明書步驟進行。最后常規(guī)行DSB染色。光鏡下觀察，凋亡細胞核呈棕褐色為陽性。計算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）用以判斷肝臟損傷程度。不同的時間點每組取2張切片，每片隨機選5個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個肝細胞核，計算凋亡細胞百分比的均數(shù)，即為凋亡指數(shù)。

1.2.6 血清TNF-α、IL-1β水平檢測 采用ELISA法，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，多組間的均數(shù)比較采用一元方差分析（One-Way ANOVA），均數(shù)之間的多重比較采用Scheffe方法（方差齊）或者Tamhane方法（方差不齊）進行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝臟的病理學(xué)觀察

2.1.1 肉眼觀察肝臟大體形態(tài)學(xué)改變 對照組肝臟形態(tài)正常，被膜光滑，色澤紅潤，質(zhì)地柔軟。模型組6h無明顯肉眼可見變化，24、48h肝臟光澤差，略顯蒼白，質(zhì)地柔韌，未見明顯出血點。

2.1.2 肝臟組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察 對照組肝臟的肝小葉組織結(jié)構(gòu)完整，未見腫脹、變性、壞死（圖1A）。模型組6h可見肝細胞輕度變性、濁腫，未見壞死（圖1B）；24h時可見肝細胞廣泛濁腫，點灶狀壞死，炎癥細胞浸潤，中央靜脈擴張充血（圖1C）；48h時見肝細胞廣泛濁腫，大量點灶狀壞死，大量炎癥細胞浸潤，中央靜脈明顯擴張充血（圖1D）。

2.2 大鼠血清ALT、AST、TBIL檢測結(jié)果 模型組ALT在24、48h較對照組明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=63.63，P＜0.01）；模型組 AST在6、24、48h較對照組明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=76.15，P＜0.01），24h達頂峰，48h開始下降，但仍高于對照組；模型組TBIL水平在24h明顯升高，48h仍維持高水平，均與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=28.53，P＜0.01），見表1。

表1 各組血清ALT、AST、TBIL檢測結(jié)果（，n=8）

表1 各組血清ALT、AST、TBIL檢測結(jié)果（，n=8）

組別 ALT（IU／L） AST（IU／L） TBIL（mmol／L）對照組59.88±8.71 57.64±13.71 14.00±1.23模型組6h 504.50±143.61 626.875±143.53 25.36±12.09模型組24h3 204.88±791.40 3 662.50±725.66 65.10±23.15模型組48h2 382.88±695.54 1 936.63±727.83 58.49±3.43

圖1 各組小鼠肝臟病理組織圖 （HE×400）

2.3 肝組織細胞凋亡的TUNEL分析 如圖2A所示，對照組肝組織未見凋亡細胞。模型組6h可見少許凋亡細胞（圖2B），AI為6.40±1.43；24h及48h時凋亡細胞較6h增多（圖2C、D），AI分別為為29.30±4.19、33.00±6.99，與6h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.92，P＜0.01）。

2.4 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平檢測結(jié)果 模型組TNF-α與IL-1β在6h即達峰值，與各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F分別為317.57、38.64，P＜0.01），24h開始下降，48h明顯降低，與6h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F為102.65、19.15，P＜0.01），但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠肝細胞凋亡檢測結(jié)果（TUNEL×400）

表2 各組血清IL-1β、TNF-α水平檢測結(jié)果（，n=8）

表2 各組血清IL-1β、TNF-α水平檢測結(jié)果（，n=8）

Δ：P＜0.01，與對照組比較；＊：P＜0.01，與模型組6h比較。

組別 TNF-α（pg／mL） IL-1β（pg／mL）對照組22.35±1.24 47.13±6.51模型組6h 1 275.42±105.24Δ 100.75±14.31Δ模型組24h 1 128.56±87.34Δ＊ 84.25±11.74Δ＊模型組48h 563.47±119.72Δ＊ 64.75±8.03Δ＊

3 討 論

肝臟是機體重要的解毒器官，肝功能受損是燒傷、膿毒血癥、感染性休克等多種危重疾病后續(xù)出現(xiàn)多器官損傷和多器官功能衰竭的重要環(huán)節(jié)，而LPS血癥是引起肝功能損害的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一［3］，因此，研究LPS所致肝損傷后的變化特點及作用機制具有重要意義。

由于LPS與存在于血漿中的LPS結(jié)合蛋白（LBP）結(jié)合后形成可溶性的LBP-LPS復(fù)合體，與肝細胞表面的CD14受體相結(jié)合，直接作用于肝細胞，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程激發(fā)細胞反應(yīng)，產(chǎn)生多種生理效應(yīng)和病理損害，形成對肝臟的第一次打擊［4］，導(dǎo)致肝細胞的破壞；D-GaLN作為肝細胞磷酸尿嘧啶核苷的消耗劑，具有高度特異性，對肝臟對LPS的敏感性有明顯的放大效應(yīng)，兩者綜合作用肝臟后的病理表現(xiàn)為肝細胞彌漫性變性、壞死、炎癥細胞的浸潤等［5］。本研究通過利用LPS＋D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷，發(fā)現(xiàn)肝臟在6h即出現(xiàn)變性，24、48h出現(xiàn)壞死，中心靜脈擴張充血，大量炎癥細胞浸潤，而作為反應(yīng)肝臟功能的重要指標模型組ALT、AST和TBIL在6h均有升高，24h明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并達到頂峰，ALT、AST均在48h開始下降，但仍高于對照組，而TBIL在48h仍維持高水平。這與肝細胞病變出現(xiàn)的時間相吻合，這也提示了肝臟是重癥感染的受累器官之一，LPS肝損傷出現(xiàn)早、進展快，在短期內(nèi)造成肝組織嚴重的病理損傷，因此，早期進行保肝治療顯得尤其重要。

細胞凋亡（apoptosis）是生物體內(nèi)廣泛存在的由特定基因控制、以細胞DNA降解為特征、無明顯細胞溶解的細胞自殺過程，是機體維持自身穩(wěn)定的一種機制。它不僅存在于生長、發(fā)育等一般的的生命過程，而且還廣泛參與了許多疾病的病理機制［6］。本實驗中發(fā)現(xiàn)肝細胞在LPS作用6h后就出現(xiàn)了凋亡，后隨著時間的推移，凋亡細胞逐漸增加，成為該急性肝損傷重要的形態(tài)學(xué)改變之一。LPS誘導(dǎo)肝細胞凋亡受復(fù)制的機制調(diào)控。研究表明，TNF-α在LPS肝損傷發(fā)生細胞凋亡中扮演了關(guān)鍵角色。Morikawa等［7］用LPS＋D-GalN誘導(dǎo)的急性肝衰竭，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了肝細胞的大量凋亡，他們的研究發(fā)現(xiàn)使用抗TNF-α的抗體可以阻止這種凋亡的發(fā)生；且重組TNF-α的應(yīng)用也可引起D-GalN致敏小鼠發(fā)生肝細胞的凋亡，由此推斷TNF-α在肝細胞凋亡中扮演了重要的角色。Liu等［2］認為LPS誘導(dǎo)肝細胞凋亡在早期階段與誘導(dǎo)型一氧化氮合成的酶（iNOS）基因的高表達密切相關(guān)，而在中后期則受到了p53基因的調(diào)控；Kuhla等［8］也證實細胞毒性T淋巴細胞（NK）釋放的穿孔素（perforin），顆粒酶（granzyme）也介導(dǎo)了LPS誘導(dǎo)的肝細胞凋亡，在LPS＋D-GalN誘導(dǎo)6h可見兩者的大量釋放，引起細胞的凋亡明顯增加。除此之外，肝臟的孕烷X受體（PXR）也參與了LPS誘導(dǎo)的肝細胞凋亡，在PXR缺失鼠促分裂素原活化蛋白（MAP）激酶活性下降，并且延長了JAK2／STAT3介導(dǎo)的信號通路的活性，引起肝細胞凋亡增加［9］。

LPS除可直接引起肝細胞受損外，還可引起肝臟Kupffer細胞（kupffer cell，KC）高度活化，使其產(chǎn)生、釋放大量的活性介質(zhì)（如TNF-α、IL-1、IL-6等），形成瀑布效應(yīng)，對機體形成第二次打擊，進一步加重肝臟損傷［10］，此外，LPS還能誘導(dǎo)還能激活NALP3及NALP1炎癥小體（inflammasome），并進一步激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-1，活化的caspase-1能將前IL-1β和proIL-18分別剪切為IL-1β和IL-18，增加了IL-1β的生成［11］。TNF-α被認為是引起這一病理過程的始動因子，對肝細胞損傷起著主導(dǎo)性的作用，它對肝臟既可以直接產(chǎn)生損傷作用，還可以通過氧化應(yīng)激途徑致?。?2］；IL-1β則是重要的協(xié)同因子［13］，抑制兩者的產(chǎn)生能明顯減少LPS誘導(dǎo)的肝損傷［14-15］。本實驗進一步研究了LPS肝損傷后炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β變化特點，研究發(fā)現(xiàn)在LPS作用DGalN致敏肝臟6h后，TNF-α和IL-1β在6h即達到峰值，24h仍維持在較高水平，48h雖有下降，但仍高于正常，這既符合血清ALT、AST、TBIL水平及肝細胞凋亡檢測結(jié)果，也說明TNF-α、IL-1β在LPS肝損傷發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色，他們的持續(xù)存在是引起了肝臟病理繼續(xù)惡化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。由此可見，早期抑制包括TNF-α、IL-1β在內(nèi)的炎癥介質(zhì)的生成、釋放對指導(dǎo)臨床治療LPS急性肝受損具有重要的意義。

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