王明賢，楊 華，楊志強(qiáng)

（1.樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川樂(lè)山 614000；2.中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣州 510080）

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類生命及健康，發(fā)病率較高，且有繼續(xù)增高的趨勢(shì)。通過(guò)影像學(xué)及病理學(xué)檢查雖可發(fā)現(xiàn)，但由于無(wú)法發(fā)現(xiàn)隱性病灶、亞臨床病灶及微小轉(zhuǎn)移灶的資料與證據(jù)，目前做到早期發(fā)現(xiàn)尚存在一定的難度，大部分患者在出現(xiàn)臨床癥狀而就診時(shí)疾病已經(jīng)處于中晚期，從而錯(cuò)過(guò)手術(shù)時(shí)間窗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌的5年生存率不足15%［1］。近年來(lái)，腫瘤基因類標(biāo)志物研究取得長(zhǎng)足進(jìn)展，已經(jīng)成為腫瘤分子診斷的重要內(nèi)容之一，通過(guò)分析腫瘤相關(guān)基因的關(guān)系、類型、表達(dá)及缺陷等，最終達(dá)到腫瘤早期診斷的目的［2］。本研究采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)肺癌相關(guān)基因LUNX、CK19、CEA、MUC1及Survivin進(jìn)行檢測(cè)分析并建立輔助診斷指數(shù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年9月至2011年9月于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院胸外科行手術(shù)治療的肺癌患者34例，其中男19例，女15例；年齡27～67歲，平均（46.72±5.88）歲；所有患者均經(jīng)過(guò)術(shù)后病理檢查確診。應(yīng)用世界衛(wèi)生組織（WHO）1999年對(duì)肺癌的組織學(xué)分類方法，發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌（SCLC）患者12例，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者22例；按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）1997年對(duì)肺癌TNM分期方法進(jìn)行分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期14例，Ⅳ期4例。收集患者手術(shù)切除的腫瘤、腫瘤切緣組織及切緣周圍2cm組織。另取同期10例行肺大泡切除術(shù)患者肺組織作為正常對(duì)照組。本研究對(duì)術(shù)前評(píng)價(jià)具有手術(shù)適應(yīng)證患者進(jìn)行手術(shù)，有些SCLC以及Ⅳ期的NSCLC均為術(shù)后補(bǔ)充診斷。

1.2 方法

1.2.1 mRNA提取 將組織置入1.5mL的RNA裂解液（購(gòu)自美國(guó)Promega公司），再加入11μLβ-巰基丙醇進(jìn)行勻漿，分裝入離心管中，加入水飽和酚與氯仿，充分震蕩后冰浴30min后，于4℃以12 000r／min離心10min，吸取上清液，加入等體積異丙醇后12 000r／min離心15min。重新加入β-巰基丙醇、RNA裂解液與異丙醇，12 000r／min離心后留取沉淀。使用RNA提取試劑盒RNAgents（購(gòu)自美國(guó)Promega公司）提取mRNA，具體步驟參照該試劑盒說(shuō)明書。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ImRrom-Ⅱ（購(gòu)自美國(guó)Promega公司）與 M-MLV試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Promega公司），采用隨機(jī)引物，整個(gè)過(guò)程均參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)均根據(jù)GenBank中LUNX、CK19、CEA、MUC1及Survivin的mRNA序列進(jìn)行，采用AllelelD 4.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，最終由北京博奧森科技有限公司進(jìn)行合成，具體序列如下。LUNX基因，上游：5′-CTC ATT GTC TTC TAC GGG CTG TT-3′，下游：5′-GGC AGG GCT GGA TTC ACA T-3′，片段大小104bp；CK-19基因，上游：5′-AGGTGG ATT CCG CTC CGG GCA-3′，下游：5′-AGC TCC CTG TCC TTC TAG TG-3′，片段大小338bp；CEA基因，上游：5′-TGC TCA CAG CCT CAC TTC-3′，下游：5′-CCA TCC ACT CTT TCA CCT T-3′，片段大小169bp；MUC1基因，上游：5′-CGT CGT GGA CAT TGA TGG TAC C-3′，下游：5′-GGT ACC TCC TCT CAC CTC CTC CAA-3′，片段大小287bp；Survivin基因，上游：5′-CCG CAT ACA GTC GAG AGA-3′，下游：5′-GTG TAG GGT GTA GAA TCC TGT TCA-3′，片段大小121bp。

表1 肝癌相關(guān)基因的差異表達(dá)（）

表1 肝癌相關(guān)基因的差異表達(dá)（）

基因 正常肺組織 手術(shù)切緣組織 癌旁組織 腫瘤組織P 8 0.002 CK19 1.53±3.72 15.39±4.11 29.48±3.20 34.75±3.25 0.001 CEA 1.50±0.33 8.96±2.54 139.69±27.04 696.58±130.05 0.000 MUC1 1.44±0.29 5.10±0.55 19.04±3.99 55.47±1.86 0.001 Survivin 1.05±0.32 4.77±5.21 11.93±3.30 95.LUNX 1.77±0.56 2.03±0.49 6.06±0.55 7.69±0.3 44±14.60 0.002

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用SYBR GreenⅠ染料法對(duì)樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，應(yīng)用Ex Tap試劑盒以及熒光定量ABI 7900型（ABI，美國(guó)）實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行，操作均按照廠家及試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，60℃退火1min，71℃延伸1min，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后于71℃下延伸1min，所得結(jié)果用IQ5軟件進(jìn)行讀數(shù)分析，內(nèi)參采用G3PHD基因。待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算（△CT=CT待測(cè)-CT內(nèi)參；△△CT=△CT待測(cè)-△CT），當(dāng)計(jì)算出的2-△△CT值相差3倍時(shí)，即認(rèn)為相關(guān)基因有差異表達(dá)。

1.3 多個(gè)相關(guān)基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系建立 將合成好的相關(guān)基因cDNA混合，連續(xù)進(jìn)行2倍梯度稀釋，得到相關(guān)基因與內(nèi)參G3PHD的熒光曲線，計(jì)算得到logcDNA濃度對(duì)△CT值直線，內(nèi)參與待測(cè)基因擴(kuò)增效率抑制，應(yīng)用2-△△CT法適合對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2-△△CT法相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè) LUNX、CK19、CEA、MUC1及Survivin基因表達(dá)均上調(diào)，分別上調(diào)88.23%，75.42%，85.01%，66.42%和70.66%；在正常肺組織、手術(shù)切緣組織、癌旁組織與腫瘤組織中表達(dá)兩兩比較或多個(gè)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），均具有從正常肺組織到腫瘤組織明顯遞減的趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

2.2 建立分子輔助診斷指數(shù) 根據(jù)2-△△CT法所得數(shù)值，該5種肺癌相關(guān)基因在組織中上調(diào)3倍或3倍以上的個(gè)數(shù)建立分子輔助診斷指數(shù)（與正常肺組織相對(duì)表達(dá)量相差3倍者計(jì)為輔助診斷指數(shù)增加1）［3］，因此本研究中分子輔助診斷指數(shù)為0～5。經(jīng)過(guò)計(jì)算可知，正常肺組織輔助診斷指數(shù)為1.2±0.51，手術(shù)切緣組織為2.4±0.64，癌旁組織為3.36±0.43，腫瘤組織為4.65±0.38。手術(shù)切緣組織、癌旁組織與腫瘤組織均較正常肺組織顯著升高，以腫瘤組織最為明顯。當(dāng)以正常肺組織作為對(duì)照，設(shè)定輔助診斷指數(shù)大于或等于3.5為肺癌時(shí)，受試者工作特征曲線（ROC曲線）敏感度為95%，特異度為92%，陽(yáng)性結(jié)果預(yù)示值（PPV）=95.33%，陰性結(jié)果預(yù)示值（NPV）=98.00%，說(shuō)明分子輔助診斷指數(shù)可提高診斷準(zhǔn)確性。

2.3 分子輔助診斷指數(shù)與WHO組織分型及UICC TNM分期的關(guān)系 對(duì)于12例SCLC患者及22例NSCLC患者，兩組輔助診斷指數(shù)分別為3.69±0.24與3.98±0.30，二者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)于TNM分期，以Ⅳ期患者得分最高，Ⅰ期患者得分最低，得分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

隨著腫瘤分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識(shí)亦在不斷更新。分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)腫瘤基因標(biāo)志物的檢測(cè)用于腫瘤發(fā)現(xiàn)與診斷，是目前的研究熱點(diǎn)之一［4］。傳統(tǒng)對(duì)于單基因的研究用于診斷腫瘤時(shí)，存在較高的假陽(yáng)性與假陰性，從而造成漏診與誤診的發(fā)生［5］。因此，采用多個(gè)相關(guān)基因標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)并尋找新的標(biāo)志物，可降低漏診、誤診的發(fā)生率，最終提高腫瘤的診斷率。

LUNX即肺特異性蛋白X，該基因定位與20p11.1-q12，長(zhǎng)度為1 015bp，共編碼26個(gè)氨基酸，具有較強(qiáng)的組織特異度，在肺外未發(fā)現(xiàn)表達(dá)。LUNX對(duì)肺癌患者外周血／淋巴等部位的未轉(zhuǎn)移具有較高的特異度，因此可以作為一種新型的肺癌基因標(biāo)志物［6］。LUNX mRNA在肺癌Ⅲ期與Ⅳ期的檢出率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者，即LUNX mRNA的表達(dá)隨著TNM分期的提高而增高［7］。LUNX mRNA水平與腫瘤負(fù)荷及轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)［8］。CK-19屬于細(xì)胞角蛋白，是角蛋白的可溶性片段，可以作為上皮來(lái)源腫瘤的敏感標(biāo)志物［9］。CEA是正常組織不表達(dá)的一種分泌糖蛋白，其基因水平檢查的敏感度高于蛋白水平?，F(xiàn)認(rèn)為，如果檢出CEA mRNA，可以從理論上推斷有腫瘤細(xì)胞的存在［10］。已經(jīng)有學(xué)者檢測(cè)患者體內(nèi) MUC1作為肺癌發(fā)生播散轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志，通過(guò)logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血MUC1mRNA水平與TNM分期及腫瘤細(xì)胞分化程度均存在密切關(guān)系［11］。Survivin基因全長(zhǎng)15kb，主要生理功能與胚胎細(xì)胞及增殖細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化有關(guān)。在大多數(shù)人類腫瘤存在高表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中Survivin mRNA水平高的患者預(yù)后較差，可作為判斷肺癌預(yù)后的指標(biāo)［12］。

本研究在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選擇肺癌組織中表達(dá)高、特異度好的上述基因，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè)并初步建立輔助診斷指數(shù)。LUNX、CK19、CEA、MUC1及Survivin基因在肺癌組織中表達(dá)最高，正常組織中表達(dá)最低，符合既往文獻(xiàn)。統(tǒng)計(jì)得出的分子輔助診斷指數(shù)對(duì)于診斷肺癌有良好的特異度與敏感度。此外，該分子輔助診斷指數(shù)還與肺癌的TNM分期有關(guān)，分期愈高，分子輔助診斷指數(shù)愈高，說(shuō)明該分子輔助診斷指數(shù)對(duì)于肺癌的臨床分期亦具有一定的預(yù)測(cè)與指導(dǎo)意義。

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