代紅瑩，張曉靜

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院檢驗(yàn)科 402160）

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）是一種嗜黏膜和皮膚上皮的雙鏈閉合環(huán)狀的小DNA病毒，相對(duì)分子質(zhì)量約為8×103。目前100多種亞型已被鑒定，其中約40余種與人類生殖器皮膚黏膜病變相關(guān)［1］。HPV亞型可分為高危型和低危型兩類，低危型以HPV-6、11最為常見(jiàn)，主要引起尖銳濕疣等良性病變；高危型以 HPV-16、18、31、52、58最為常見(jiàn)，常引起宮頸癌等惡性病變［2］。HPV亞型在不同地區(qū)不同人群分布情況不一［3］。目前，HPV在非洲和拉丁美洲的感染率較高，

絕大多數(shù)性活躍女性至少感染了一種HPV。本研究主要對(duì)重慶永川地區(qū)的適齡婦女進(jìn)行23種常見(jiàn)亞型檢測(cè)，以確定重慶永川地區(qū)HPV感染的常見(jiàn)類型，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究所有樣本均來(lái)源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院，采集對(duì)象為2007年1月至2010年10月隨機(jī)前來(lái)醫(yī)院就診的患者。樣本采集后隔離保存于宮頸脫落細(xì)胞收集管中，并盡可能于樣本到達(dá)后的當(dāng)天進(jìn)行DNA分離處理，少數(shù)來(lái)不及處理的樣品置于-20℃冰箱中保存，1周內(nèi)進(jìn)行處理。

1.2 儀器和試劑 FYY-3型分子雜交儀（興化市分析儀器廠）、PCR擴(kuò)增儀（杭州朗基有限公司）、HPV DNA分型基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)（亞能生物技術(shù)有限公司）、其他試劑（國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.3 方法

1.3.1 樣品HPV DNA獲取和處理 用宮頸脫落細(xì)胞采集器取得宮頸表皮脫落細(xì)胞，對(duì)于生殖器或肛周疣體增生（懷疑為尖銳濕疣）患者，用濕棉拭子采集疣體表皮脫落細(xì)胞或疣體組織。將取樣后的棉拭子或采集器放入備有1mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，充分漂洗后將棉拭子貼壁擠干，安全丟棄。將漂洗過(guò)的生理鹽水或洗脫液全部轉(zhuǎn)移到1.5mL微量離心管中，13 000r／min離心10min，棄去上清，保留管底的細(xì)胞塊，加入50mL細(xì)胞裂解液懸浮沉淀，沸水浴10min，13 000r／min離心10min，-20℃保留上清待用。疣體組織DNA的提取用組織DNA提取試劑盒按使用說(shuō)明書(shū)方法提取。

1.3.2 HPV DNA片段的PCR擴(kuò)增 取PCR反應(yīng)管于5 000 r／min離心2s，根據(jù)HPV L1基因設(shè)計(jì)23種亞型的特異性探針，針對(duì)這一片段設(shè)計(jì)通用引物，同時(shí)以人類基因組的看家基因beta-globin作為PCR對(duì)照。按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50℃15 min，95℃10min，94℃30s，42 ℃ 90s，72℃ 30s，40個(gè)循環(huán)，72℃5min。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 14.2μL，反應(yīng)緩沖液（含 MgCl2）2.5μL，三磷酸脫氧核糖核苷（dNTP）2μL，引物0.5μL／條，樣品DNA 5μL，Taq酶0.3μL，反應(yīng)總體系25μL。

1.3.3 雜交和顯色 取15mL塑料離心管，標(biāo)明編號(hào)，放入標(biāo)有同樣編號(hào)的膜條，加入A液5mL（2×SSC，0.1%SDS，pH 7.4）及所有PCR產(chǎn)物。將塑料管放入沸水浴中加熱10min，放入雜交箱51℃雜交1.5h。同時(shí)取50mL塑料管，加入40 mL B液（0.5×SSC，0.1%SDS，pH 7.4）于雜交箱或水浴箱中預(yù)熱至51℃。取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50mL管中，于51℃輕搖洗滌15min。A液配制1∶2 000的過(guò)氧化物同工酶（POD）溶液，室溫輕搖浸泡膜條15min。棄去POD溶液，用A液室溫輕搖洗2次，每次5min，然后再用C液室溫洗膜1～2 min。同時(shí)配制顯色液，將膜條浸泡于顯色液中避光顯色15min左右，即可見(jiàn)斑點(diǎn)顯現(xiàn)，若顯色較弱可適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，顯色完畢將膜條浸泡在水中清洗，最后取出膜條于4℃保存。

1.3.4 結(jié)果判定 膜條上有24個(gè)方格，依次排列著23種HPV型別，另一個(gè)方格為質(zhì)控點(diǎn)。結(jié)果判定時(shí)，首先看膜條的質(zhì)控點(diǎn)是否有藍(lán)色圓點(diǎn)出現(xiàn)，若有則判本次實(shí)驗(yàn)成功，然后看哪些方格有藍(lán)色圓點(diǎn)出現(xiàn)，哪個(gè)方格有藍(lán)色圓點(diǎn)出現(xiàn)則判定與其相對(duì)應(yīng)的HPV型陽(yáng)性，每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)有陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Micro EXCEL軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，制作表單進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入，最后得到成型的數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)目前公認(rèn)的18種高危型，5種低危型在不同人群中的分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和分析。

2 結(jié) 果

2.1 HPV感染的型別分布 在檢測(cè)出的955例陽(yáng)性標(biāo)本中，除HPV-44、MM4未檢測(cè)出來(lái)外，其他各型均有檢出。其中高危型感染 HPV-16最多為（34.45%），其次為HPV-58（11.52%）；低危型感染HPV-43為首（9.84%），其次為 HPV-11（8.69%）。高危型檢出數(shù)是低危型檢出數(shù)的3.5倍。

表1 HPV亞型感染情況

續(xù)表1 HPV亞型感染情況

2.2 HPV各型感染情況 在混合感染的249例標(biāo)本中，兩種亞型的混合最為常見(jiàn)，占感染檢出率的19.27%；3種及以上亞型感染檢出率僅占總感染的6.81%。高危型和低危型混合感染110例，占總感染11.52%；高危型混合感染118例，占總感染的12.36%；低危型混合感染13例，占總感染的1.36%。

表2 HPV感染情況

2.3 HPV感染的年齡分布 本研究將感染者分為≤20歲、＞20～30歲、＞30～40歲、＞40歲4個(gè)年齡組，其HPV的感染率依次為6.49%、22.93%、39.27%、31.31%，＞30～40歲年齡組是HPV感染的主要年齡階段。

表3 不同年齡HPV感染情況

3 討 論

3.1 HPV感染狀況 HPV是一種通過(guò)性生活傳播的病毒，通常感染沒(méi)有明顯癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)，至少有50%的婦女其一生都會(huì)感染HPV，而50歲之前感染HPV的幾率高達(dá)80%。非洲HPV感染率約22.1%，亞洲8.0%，北美洲11.3%，中美洲和墨西哥20.4%，歐洲8.1%［4］，不同地區(qū)有一定差異，這可能是由于HPV本身的地域性差異及不同的研究者選擇的目標(biāo)人群和采用的檢測(cè)方法不同引起的。

3.2 HPV亞型分布特點(diǎn) 研究表明，HPV亞型分布也存在地域性差異，不同亞型 HPV感染致癌性及其后果不同［5］。Bao等［6］研究的中國(guó)宮頸癌常見(jiàn)亞型為 HPV-16、18、58、33、52、45、31及35型；宮頸癌前病變中常見(jiàn)亞型為 HPV-16、58、52、18、33、31。

本研究顯示HPV高危型感染中常見(jiàn)的亞型為HPV-16、58、52、33、18、66、56，與前人的研究有所偏差，原因可能歸結(jié)為HPV亞型分布的地域性差異；低危型感染中 HPV-43、11、6、42均占有較大比例，與前人結(jié)果比較6、11沒(méi)有占有主導(dǎo)地位，但是4種亞型均是廣范圍報(bào)道的HPV低危型亞型。

3.3 單一感染與多重感染 本研究中HPV多重感染的比例為26.08%，低于Bachtiary等［7］（43.9%），與其他文獻(xiàn)一致［8］。不少學(xué)者認(rèn)為HPV的多重感染并不少見(jiàn)，檢出率高低除與研究人群有關(guān)外，還與檢測(cè)方法有關(guān)。在本研究中，多重感染主要是二重感染，最常見(jiàn)的為HPV-16合并的感染。Ho等［9］學(xué)者認(rèn)為HPV多重感染者出現(xiàn)持續(xù)感染的危險(xiǎn)性更大，支持本研究結(jié)果。

3.4 HPV與宮頸癌的關(guān)系 宮頸癌發(fā)病率高，在女性惡性腫瘤的發(fā)病率中位居第2。研究表明，HPV的持續(xù)感染是宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）的主要病因。高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生、發(fā)展的必要條件。宮頸癌患者的高危型HPV感染陽(yáng)性率為100%，CINⅡ和CINⅢ為97%，CINⅠ為61.4%。

不同HPV亞型的致病力不同，據(jù) Munoz等［10］統(tǒng)計(jì)，雖然各級(jí)別病變間感染型別存在差異，但高危型HPV-16、58、18、56、33在各級(jí)別病變組均占有一定優(yōu)勢(shì)，本研究亦支持上述結(jié)果。HPV多重感染率隨病變級(jí)別增加而增加，一定程度上說(shuō)明多重感染對(duì)宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用。結(jié)果與Fife等［11］的研究一致，但也有不少學(xué)者提出反對(duì)意見(jiàn)［10］。

3.5 HPV與年齡的關(guān)系 HPV與年齡具有相關(guān)性，據(jù)de Sanjose等［4］的研究顯示：HPV感染高峰在34歲之前，35～44歲的HPV感染率隨之降低，而對(duì)于大于45歲組，除亞洲外其他地區(qū)的感染率又有所增加。本研究結(jié)果有所不同，原因可能在于，統(tǒng)計(jì)的標(biāo)本量有限，不能客觀反映HPV感染年齡本身，也存在患者來(lái)源集中的問(wèn)題，HPV感染一般癥狀不明顯，很多年輕婦女忽略了HPV的常規(guī)檢查也是一個(gè)很大的因素。

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