周林，任玉珍，杜杰，張曉莉，金鋒

（1.中國(guó)藥材公司中藥質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100195；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；3.四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，四川 江油 621700；4.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008）

附子不同炮制方法比較分析△

周林1，2*，任玉珍1，杜杰1，張曉莉3，金鋒4

（1.中國(guó)藥材公司中藥質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100195；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；3.四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，四川 江油 621700；4.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008）

目的：采用高效液相色譜法分析附子不同炮制品中6個(gè)生物堿的含量，研究《中國(guó)藥典》炮制法、蒸制法、炒制法之間的差異。方法：采用《中國(guó)藥典》2010年版附子含量測(cè)定項(xiàng)下方法檢測(cè)；運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果：各成分分離良好；蒸附片、炒附片、黑順片、白附片、淡附片、炮附片中雙酯型生物堿的量都得到有效降低，但蒸附片和炒附片中單酯型生物堿的含量明顯增加。結(jié)論：蒸制法、炒制法與《中國(guó)藥典》炮制法一樣，具有相同的炮制減毒能力，但蒸制法和炒制法又能增加毒性小、療效好的單酯型生物堿類(lèi)的量，優(yōu)于《中國(guó)藥典》炮制法。

附子；炮制；高效液相色譜法；含量比較

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根。具有回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛的功能［1］。附子中主要含烏頭類(lèi)生物堿，是有效成分，也是毒性成分，為保證其臨床療效和安全應(yīng)用，須經(jīng)炮制才能使用。附子炮制減毒的方法早在漢代就有記載，歷代醫(yī)藥專著中有炮、炒、煨、蒸、煮等炮制方法。在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方面，自《中國(guó)藥典》1963年版［2］起即收載了附子4個(gè)飲片規(guī)格黑順片、白附片、淡附片、炮附片的炮制方法。除了《中國(guó)藥典》炮制法（《藥典》法）之外，附子采用蒸制法和炒制法進(jìn)行炮制減毒在歷代本草專著中也有記載，如清代《握靈本草》［3］中有“去皮蒸過(guò)”，元明時(shí)期《壽世保元》、《醫(yī)學(xué)綱目》記載了附子“炒”［4-5］。臨床應(yīng)用附子飲片中，部分老中醫(yī)認(rèn)為《藥典》法中附子浸泡膽巴溶液后有效成分損失殆盡，與《景岳全書(shū)》［6］、《本草問(wèn)答》［7］、《本草從新》［8］、《本草正義》［9］等表述的觀點(diǎn)相一致，并主張采用蒸制法和炒制法對(duì)附子進(jìn)行炮制減毒。作者采用《中國(guó)藥典》2010年版附子項(xiàng)下生物堿含量測(cè)定方法［1］，考察《藥典》法、蒸制法和炒制法在炮制附子方面的作用，運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析不同炮制方法的差異性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，蒸制法、炒制法與《藥典》法一樣，具有相同的炮制減毒能力，但蒸制法和炒制法又能增加毒性小、療效好的單酯型生物堿類(lèi)的量，優(yōu)于《藥典》法。

1 儀器、試劑與材料

Waters 2695高效液相色譜儀，2998二極管陣列檢測(cè)器；DENVER電子分析天平（十萬(wàn)分之一，北京賽多利斯儀器系列有限公司）；KQ-251DA數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W，頻率40 kHz）。乙腈、四氫呋喃為色譜純（Fisher公司），異丙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、醋酸銨、三氯甲烷為分析純（北京化學(xué)試劑公司）。

對(duì)照品：烏頭堿（110720-200410）、次烏頭堿（110798-200404）、新烏頭堿（110799-200404）、苯甲酰次烏頭原堿（111796-200901）、苯甲酰烏頭原堿（111794-200901）、苯甲酰新烏頭原堿（111795-200901），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

黑順片（批號(hào)：H060801～H060809，H100614，H100827，H110820，H110801）、白附片（批 號(hào)：B030905～B030907，B030909，B110301）、淡附片（批號(hào)：D080901～D080907）、炮附片 （批號(hào)：P080904～P08097）：四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司根據(jù)《藥典》炮制方法生產(chǎn)。

蒸附片（批號(hào)：C111001～C111005，C120301～C120305）：取生附片5kg，投入蒸制容器內(nèi)，常壓蒸制，至出現(xiàn)油面光澤，低溫干燥。

炒附片（批號(hào)：Z120301～Z120310）：取河砂投入炒鍋內(nèi)，炒至滑利狀態(tài)，投入凈生附片5kg，炒至外表深棕黃色，斷面棕黃色，取出迅速篩去砂子，放涼。

蒸附片、炒附片均為四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司試生產(chǎn)樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版附子含量測(cè)定項(xiàng)下液相條件，選擇Waters SunfireTMC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以乙腈 －四氫呋喃（25∶15）為流動(dòng)相A，以0.1mol·L－1醋酸銨溶液（每1 000mL加冰醋酸0.5mL）為流動(dòng)相B，梯度洗脫，0～48min，15％～26％A；48～49min，26％～35％A；49～58min，35％A；58～65min，35％～15％A。檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm；柱溫：30℃；流速：0.8mL·min－1；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品適量，精密稱定，用異丙醇－三氯甲烷（1∶1）溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為苯甲酰新烏頭原堿0.021 5mg·mL－1、苯甲酰烏頭原堿0.016 9mg·mL－1、苯甲酰次烏頭原堿 0.015 0mg·mL－1、新烏頭堿 0.013 2mg·mL－1、次烏頭堿0.010 9mg·mL－1、烏頭堿 0.011 1mg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4℃冰箱待用。

2.3 供試品溶液的制備

取附子各炮制品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3mL，精密加入異丙醇－乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫在25℃以下）30min，放冷，再稱定重量，用異丙醇－乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤氘惐迹燃淄椋?∶1）混合溶液3mL溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 樣品檢測(cè)結(jié)果

按照《中國(guó)藥典》規(guī)定的含量檢測(cè)方法，檢測(cè)48批附子飲片的6種生物堿含量，見(jiàn)表1。計(jì)算3種雙酯型生物堿和3種單酯型生物堿總和，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，《藥典》法、炒制法、蒸制法炮制的48批附片都完全符合標(biāo)準(zhǔn)?；旌蠈?duì)照品（A）、生附片（B）HPLC圖見(jiàn)圖1。

表1 附子樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）/％

續(xù)表1

圖1 混合對(duì)照品（A）、生附片（B）HPLC圖

2.5 不同炮制方法炮制的樣品生物堿類(lèi)成分聚類(lèi)分析

分別對(duì)生附片、黑順片、白附片、淡附片、炮附片、蒸附片、炒附片所檢測(cè)的3種單酯型生物堿含量和3種雙酯型生物堿含量進(jìn)行聚類(lèi)分析。分析結(jié)果顯示，54批樣品共分為3組，未炮制（生附片）歸為一組，命名為group 1；《藥典》法炮制的飲片（黑順片、白附片、淡附片、炮附片）歸為一組，命名為group 2；蒸制法（蒸附片）、炒制法（炒附片）歸為一組，命名為group 3。

2.6 不同炮制方法炮制的樣品中雙酯型生物堿類(lèi)成分分析

根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果，分別對(duì)每2組的新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿含量和雙酯型生物堿總和進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3組樣品雙酯型生物堿比較分析P值

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，蒸制法、炒制法和《藥典》法炮制的附子樣品與生附片中3種雙酯型生物堿含量和雙酯堿總和差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即3種雙酯型生物堿含量都下降明顯（P＜0.05）；而蒸制法、炒制法與《藥典》法炮制的附子樣品中雙酯型生物堿含量和雙酯堿總和差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），即不能認(rèn)為蒸制法、炒制法與《藥典》法炮制減毒的效果不相同。

2.7 不同炮制方法炮制的樣品中單酯型生物堿類(lèi)成分分析

根據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果，分別對(duì)每2組的苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含量和單酯型生物堿總和進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3組樣品單酯型生物堿比較分析P值

從統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，《藥典》法炮制的飲片（黑順片、白附片、淡附片、炮附片）與生附片相比較，不能認(rèn)為苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、單酯型生物堿總和的量與對(duì)應(yīng)的生附片中不同（P＞0.05），只有苯甲酰次烏頭原堿含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），綜合分析可知，《藥典》法炮制后飲片中單酯型生物堿的量與生附片中的量基本相同。

蒸制法、炒制法炮制的樣品與生附片、《藥典》法炮制的飲片（黑順片、白附片、淡附片、炮附片）中3種單酯型生物堿含量及單酯堿總和差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即炒制法、蒸制法炮制的樣品中3種單酯型生物堿含量及總和明顯高于《藥典》法和生附片。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定附子中雙酯型和單酯型6種生物堿含量，附子炮制后雙酯型生物堿含量顯著下降，蒸制法、炒制法和《藥典》法促進(jìn)雙酯類(lèi)生物堿向單酯類(lèi)生物堿轉(zhuǎn)化的能力相同（減毒），蒸附片、炒附片、黑順片、白附片、炮附片、淡附片中3種雙酯型生物堿含量均無(wú)明顯差異，從分析結(jié)果可以認(rèn)為，《藥典》法與蒸制法、炒制法在炮制減毒作用方面是相同的。

蒸制法、炒制法與《藥典》法炮制的附片中保留苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿等藥效成分的效果不同，蒸附片和炒附片中3種單酯型生物堿含量明顯增加（增效），而黑順片、白附片、炮附片、淡附片中3種單酯型生物堿含量與生附片基本一致。雙酯型生物堿毒性大，《中國(guó)藥典》2010年版將其作為限量檢查指標(biāo)成分，而單酯型生物堿療效好、毒性小，定為含量測(cè)定指標(biāo)，其毒性是新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿的1/200［10-12］。蒸附片和炒附片3種單酯型生物堿含量明顯高于黑順片、白附片、炮附片、淡附片，推測(cè)是臨床療效優(yōu)于《藥典》法的主要原因。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：177.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京：人民衛(wèi)生出版社，1963：136.

［3］王孝濤，葉定江.歷代中藥炮制法匯典（古代）［M］.南昌：江西科技出版社，1998：97-102.

［4］龔?fù)①t.壽世保元［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：235.

［5］倪泰一，楊小軍.醫(yī)學(xué)綱目：白話精澤［M］.重慶：重慶大學(xué)出版社，1999：152.

［6］李志庸.張景岳全書(shū)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1999：1552.

［7］王咪咪，李林.唐容川醫(yī)學(xué)全書(shū)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1999：540..

［8］曲京峰，竇欽鴻.本草從新［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1990：72.

［9］浙江省中醫(yī)藥管理局《張山雷醫(yī)集》編委會(huì).張山雷醫(yī)集［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：314.

［10］王冬梅，王艷宏，李永吉，等.附子毒性、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分析方法研究進(jìn)展［J］.黑龍江醫(yī)藥，2011，24（1）：45-47.

［11］李榮宗.附子、川烏、草烏的合理炮制經(jīng)驗(yàn)［J］.海峽藥學(xué)，2001，13（2）：49-50.

［12］洪波，仇永清.附子中雙酯型烏頭堿類(lèi)成分水解減毒機(jī)理的密度泛函理論研究［J］.分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（3）：216-219.

Com parative Analysis of Different Processing M ethods in Aconiti Lateralis

ZHOU Lin1，2*，REN Yu-zhen1，DU Jie1，ZHANG Xiao-li3，JIN Feng4
（1.China National Corp.of Traditional＆Herbal Medicine，Beijing 100195，China；2.Beijing University of ChineseMedicine，Beijing 100102，China；3.Sichuan Jiangyou Zhongba T＆SDevelopment Co.LTD of Aconite Lateralis Praeparata，Jiangyou 621700，China；4.Henan University of TCM，Zhengzhou 450008，China）

Objective：By simultaneous quantification of 6 aconitum alkaloid compounds in Aconiti Lateralis to compare the differences from the different processing methods.M ethods：The method of aconitum alkloids in Aconiti Lateralis is according to Chinese Pharmacopoeia（2010 ed）.Data is carried out by SPSS 17.0 statistical analysis software.Results：The 6 compounds were separated clearly.The amount of diester-type aconitum alkaloid compounds have been effectively reduced by pharmacopoeia method，steamed method and frying method，but the monoester-type aconitum alkaloid content in zhengfupian and chaofupian was significantly increased.Conclusion：Pharmacopoeiamethod，steamed method and fryingmethod have the same processing attenuated ability.The contents ofmonoester-type aconitum alkaloid，which had low toxicity and high curative effect，are increased greatly in using the last twomethods，better than the pharmacopoeiamethod.

Radix Aconiti Lateralis；Processing；HPLC；Comparison of aconitum alkaloid

2012-07-06）

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)——附子等中藥炮制方法傳承與規(guī)范化應(yīng)用研究項(xiàng)目 （201107008）

*［通訊作者］周林，Tel：（010）61252955，E-mail：zhoulin415＠163.com