談忠鳴，張忠獻，顧 玲，胡建利，朱葉飛，祁 賢，董 晨，湯奮揚，周明浩，鮑倡俊

炭疽（Anthrax），是由炭疽桿菌（Bacillus anthracis）引起的人獸共患傳染病。人感染炭疽，根據(jù)感染途徑的不同，又分為皮膚炭疽、胃腸炭疽和肺炭疽。皮膚炭疽最為常見，主要為人接觸感染炭疽桿菌牲畜的毛皮和肉類所致，病死率不高，可以徹底治愈，甚至自愈。人也可經(jīng)呼吸道傳播導致肺炭疽，或由食用感染炭疽的牲畜肉類而引起胃腸炭疽，嚴重感染者可引發(fā)炭疽性腦膜炎，甚至死亡。炭疽桿菌在極端環(huán)境中形成芽孢，可長期存在于自然界中，無法消除。由于炭疽芽孢桿菌的穩(wěn)定性［1］和致病性，使其成為較常見的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖襲擊武器［2］。

2012年8月，連云港市疾病預(yù)防控制中心接到連云港市第四人民醫(yī)院關(guān)于發(fā)現(xiàn)疑似皮膚炭疽病例的報告，遂組織人員與當?shù)乜h疾病預(yù)防控制中心共同趕赴病例所在地進行流行病學調(diào)查。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)4例疑似皮膚炭疽病例，并采集疑似病例標本和病牛肉標本送至我實驗室進行檢測?，F(xiàn)將本實驗室的檢測結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1．1 標本采集和處理 采集4例疑似皮膚炭疽病例的血清、血球、焦痂及宰殺的病死牛肉標本。血塊和牛肉各取200μg，放入2mL無菌E－P管中；病人焦痂標本直接放入2mL無菌E－P管中。各管加入200μL無菌生理鹽水，研磨混勻成組織懸液。采用QIAGEN 公 司 試 劑 盒 （QIAamp DNA mini kit，Qiagen）提取DNA，操作步驟參照試劑盒使用說明書，核酸－80℃保存待用。

1．2 Real－time PCR 檢測 采用 Real－time PCR 方法檢測炭疽桿菌染色體上RNA聚合酶β亞單位編碼基因（rpoB）［3］、質(zhì)粒 PXO1上保護性抗原基因pag［3］、質(zhì)粒PXO2上莢膜基因（poly－γ－D－glutamic capsule）的片段capA［4］，引物序列見表1。反應(yīng)體系為：10μL Master Mix（ABI Universal TaqMan Master Mix，Applied Biosystems），300nmol／L 上下游引物，250nmol／L探針，2μLDNA 模板，H2O補至20μL。循環(huán)程序為：50 ℃ 2min，95 ℃10min，40個循環(huán)為95℃15s，60℃1min并收集信號。熒光定量PCR儀為ABI的7500Real Time PCR System。

表1 炭疽桿菌rpoB基因、pag基因和capA基因?qū)崟r熒光PCR引物及探針序列Tab．1 Primers and probes of real－time PCR for detection on specific genes（rpoB，pag，and capA）of Bacillus anthracis

1．3 毒力基因檢測 建立普通PCR方法檢測炭疽桿菌質(zhì)粒上的毒力基因。靶基因為位于質(zhì)粒PXO1上編碼炭疽桿菌毒素的水腫因子 （edema factor）cya基因，致死因子（lethal factor）lef 基因，保護性抗原（protective antigen）pag基因，以及位于質(zhì)粒PXO2上的莢膜基因（poly－γ－D－glutamic capsule）cap基因［5］。引物序列見表2。反應(yīng)體系為：10×TaKaRa LA buffer 2．5μL，dNTPs 2μL，10pmol／μL上下游引物各1μL，5UTaKaRa LA Taq酶0．15μL，DNA模板5μL，H2O補足25μL。循環(huán)程序為：94℃4min；35個循環(huán)為94℃1min，51℃40s，72℃30s；72℃5min。PCR擴增儀為ABI的9800Fast Thermal Cycler。PCR產(chǎn)物1．5%瓊脂糖電泳分析結(jié)果。

1．4 序列分析 炭疽桿菌毒力基因的PCR產(chǎn)物TaKaRa試劑盒回收（TaKaRa Mini Best Agarose Gel DNA Extraction Kit，TaKaRa）并測序，測序儀為 Applied Biosystems／HITACHI 3500xL（Hitachi High－technologies Corporation，Tokyo，Japan）。測序結(jié)果MEGA 4．0軟件進行分析。

2 結(jié) 果

2．1 流行病學調(diào)查 2012年7月來源于外省的200余頭牛，運達江蘇省連云港市贛榆縣時發(fā)現(xiàn)其中1頭病牛，當?shù)?0名村民對其進行了放血、宰殺。之后，有4人陸續(xù)出現(xiàn)發(fā)熱、局部皮膚腫脹等癥狀。收到報告后，江蘇省疾病預(yù)防控制中心立即介入調(diào)查，確定4例疑似皮膚炭疽病例中2例為臨床診斷病例，另外2例因癥狀不典型被列為醫(yī)學觀察對象，并通過“中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)”及時進行了病例個案報告。經(jīng)當?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心的主動搜索，又發(fā)現(xiàn)3名醫(yī)學觀察對象。7例病例的詳細情況見表3。

表2 毒力基因引物序列Tab．2 PCR primers for virulence genes of Bacillus anthracis

表3 流行病學調(diào)查對象基本信息及Real－time PCR檢測結(jié)果Tab．3 Results of epidemiological investigation and real－time PCR

2．2 Real－time PCR 鑒定 對4例疑似皮膚炭疽病人的臨床標本和病牛肉標本分別進行實時熒光PCR檢測。檢測的靶基因為染色體上rpoB基因、質(zhì)粒PXO1上的pag基因和質(zhì)粒PXO2上的capA基因。結(jié)果顯示只有病人的焦痂標本和病牛肉標本檢測出3種基因的熒光信號，CT值均小于35（圖1）。病人血標本中未檢測出熒光信號。

2．3 毒力基因檢測 對4例皮膚炭疽病例的焦痂標本和病牛肉標本分別進行毒力基因檢測。cya、pag和lef基因位于質(zhì)粒PXO1上，分別編碼水腫因子、保護性抗原和致死因子。與芽孢形成有關(guān)的基因如capA、capB、capC等則位于pXO2質(zhì)粒上，本次實驗以capA為靶基因。結(jié)果顯示在900bp、719bp、373bp和807bp處分別出現(xiàn)目的條帶，陰性對照無擴增條帶（圖2）。

2．4 序列分析 為驗證DNA片段的正確性，所有陽性的毒力基因PCR產(chǎn)物回收測序，GenBank中進行比對，結(jié)果證實4份病人的標本和病牛肉標本全部為炭疽桿菌質(zhì)粒上的毒力基因，且序列完全一致。挑選 JS－2012－1、JS－2012－2 和 JS－2012－beef的序列與GenBank中的國際參考株序列進行比對。4個毒力基因與炭疽桿菌的國際參考株同源性均在99%以上，僅1～3個堿基的差異。cya基因序列通過比對發(fā)現(xiàn)與美國的3株參考株（str．CDC 684，str．A 0248，str．Ames Ancestor）及意大利2株參考株（str．IT－Carb1－6241，str．IT－Carb3－6254）序列最為接近，僅相差1個堿基。pag基因序列與A16R疫苗株、美國的A0248、Ames Ancestor株及以色列的ISR1980株的序列完全相同。lef基因測序比對結(jié)果顯示江蘇序列與大部分國際參考株序列基本一致。cap基因序列比對結(jié)果顯示3株美國參考株與韓國株（str．H9401）序列完全一致，與江蘇序列存在一個堿基的差異。序列分析結(jié)果說明炭疽桿菌毒力基因相當保守，同源性非常高。與蠟樣芽孢桿菌炭疽生物型參考株（str．CI）的序列同源性在99%以上。

圖1 實時熒光PCR檢測炭疽桿菌rpoB基因、pag基因和capA基因Fig．1 Detection on specific genes（rpoB，pag，and capA）of Bacillus anthracis by real－time PCR

圖2 4種毒力基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig．2 Detection on virulence genes of Bacillus anthracis by PCRFigure above M：100bp DNA ladder marker；1：cya－JS－2012－1；2：cya－JS－20120－2；3：cya－JS－2012－3；4：cya－JS－2012－4：5：Negative：6：pag－JS－2012－1；7：pag－JS－20120－2：8：pag－JS－2012－3；9：pag－JS－2012－4；10：Negative；11：lef－JS－2012－1；12：lef－JS－20120－2；13：lef－JS－2012－3；14：lef－JS－2012－4；15：Negative．Figure below M：100bp DNA ladder marker；1：cap－JS－2012－1；2：cap－JS－20120－2；3：cap－JS－2012－3；4：cap－JS－2012－4；5：Negative；6：cya－beef；7：Negative；8：lef－beef；9：Negative；10：cap－beef；11：Negative；12：pag－beef．

3 討 論

炭疽桿菌是一種危害極大的人獸共患病原微生物，形成芽孢以后可長期存在于土壤、草木和動物的骨骼中，所以炭疽桿菌很難根除。當牛、羊等家畜啃食草根或翻動泥土時會感染炭疽桿菌而發(fā)病，人類主要通過接觸感染了炭疽的家畜毛皮或食其肉而得病。我國主要以散發(fā)或小爆發(fā)為主，皮膚炭疽最為常見，病例多集中在西、北及西南幾個省，感染后很少出現(xiàn)人與人相互傳播［6］。

2012年7－8月我省連云港贛榆縣發(fā)生一起炭疽疫情，10名當?shù)卮迕駥?頭病牛進行放血、宰殺，隨后7名村民出現(xiàn)不同程度的皮膚炭疽癥狀。為了在第一時間診斷病原，本實驗室對4名病例的臨床標本（血、焦痂）和病死牛肉標本進行 Real－time PCR快速檢測。檢測的3種靶基因分別是炭疽桿菌染色體上rpoB基因、質(zhì)粒PXO1上選擇保護性抗原pag基因和質(zhì)粒PXO2上莢膜基因cap。rpoB基因負責合成RNA聚合酶β－亞單位，是一種高度保守的管家基因，可作為鑒定細菌的標簽序列［7］。檢測pag和cap可知曉炭疽桿菌是否攜帶對應(yīng)的質(zhì)粒PXO1和PXO2。如只攜帶其中一個質(zhì)粒，為弱毒株；若兩個質(zhì)粒均攜帶，即為強毒株；如果兩個質(zhì)粒均丟失，則為無毒株。實驗結(jié)果顯示在病人的焦痂標本和病牛肉中rpoB基因、pag和cap陽性。表明本次疫情是炭疽桿菌強毒株導致。血標本中未檢測出信號，可能與病人已使用抗生素（青霉素、左氧氟沙星）有關(guān)，但不能排除炭疽桿菌不入血的可能。

為進一步驗證實時熒光PCR的結(jié)果，我實驗室對陽性標本進行四種毒力基因的鑒定并測序分析。包括質(zhì)粒PXO1上分別編碼水腫因子（edema fcator）、保護性抗原PA（protective antigen）和致死因子（lethal factor）的cya基因、pag基因和lef 基因以及質(zhì)粒PXO2上編碼 多聚－γ－D－谷氨酸莢膜的cap基因。測序結(jié)果表明，4例病人標本和病牛肉的4種毒力基因序列完全相同，進一步驗證了流行病學調(diào)查和Real－time PCR結(jié)果。通過 GenBank比對國際參考株，江蘇標本質(zhì)粒PXO1上毒力基因序列與美國 CDC 684株、Ame Ancestor株、A 0248株及疫苗株A16R最為接近，僅相差1～2個堿基，pag基因序列甚至完全相同，同源性非常高。這可能與炭疽桿菌形成芽孢后可長期保存于自然環(huán)境中，從而減少了進化頻率，使得炭疽桿菌菌株間極端同源。GenBank中炭疽桿菌質(zhì)粒PXO2的cap基因上傳序列較少。

綜上所述，本此疫情中使用的炭疽桿菌分子診斷方法可檢測病人臨床標本及動物標本，此方法快速、便捷、可靠，能區(qū)分強毒株、弱毒株和無毒株，可應(yīng)用在炭疽疫情及生物反恐的快速檢測中。毒力基因的序列分析可對疫情中的炭疽桿菌進行簡單的溯源追蹤，江蘇序列與疫苗株A16R同源性很高，說明A16R在我國炭疽菌株中具有代表性。測序的結(jié)果可以用來佐證流行病學調(diào)查結(jié)果。

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