李春峰，魯 靜，唐進(jìn)法

(1.鄭州市第六人民醫(yī)院，河南 鄭州450015；2.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000)

連翹是木犀科(Oleaceae)植物連翹(Forsythia suspensa)的干燥果實(shí)，性苦，味微寒，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，用于癰疽、瘰疬，乳癰、丹毒，風(fēng)熱感冒，溫病初起，溫?zé)崛霠I，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋澀痛［1］。連翹中主要化學(xué)成分有木脂素類、黃酮和苯乙醇苷類萜類、揮發(fā)油等［2－3］?，F(xiàn)代藥理研究表明：連翹中含有的連翹酯苷A具有抗菌、抗病毒活性，蘆丁具有抗氧化活性，兩者是主要藥效成分［4］。本文以蘆丁和連翹酯苷A作為指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法同時測定蘆丁和連翹酯苷A的含量，為連翹藥材的質(zhì)控研究提供一套可靠的分析方法。

1 藥品、試劑與儀器

連翹，購自河南省醫(yī)藥藥材有限公司，產(chǎn)地為河南嵩縣，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定為正品，批號分別為121008，121009，121010。連翹酯苷 A，純度大于98%，實(shí)驗(yàn)室自制；蘆丁，中國食品藥品檢驗(yàn)所提供，批號20091021；甲醇為色譜純；超純水，由Milll-Q制備；其余試劑為分析純。LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；KQ-300超聲波提取器，河南中良科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇 －2g/L 冰醋酸溶液(20∶80)，檢測波長 329 nm，進(jìn)樣量 10 μL，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

2.2 溶液的制備

按照參考文獻(xiàn)［5］制備。

2.2.1 混合對照品溶液

分別稱取蘆丁、連翹酯苷A對照品適量，用500 g/L甲醇溶解，分別配制成濃度為21.1，15.3 mg/L的混合溶液，過 0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜，即得。色譜圖見圖1(a)。

2.2.2 供試品溶液

取樣品粉末(40目篩)約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入500 g/L甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，并用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過濾，取濾液過 0.45 μm 的有機(jī)濾膜，即得。色譜圖見圖1(b)。

圖1 對照品及供試品的HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液 1，2，5，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件所述測定色譜峰峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)作線性回歸，得到回歸方程。蘆丁：Y=590 210X －732.27，r=0.999 9。連翹酯苷 A：Y=653 574X+686.83，r=0.999 9。表明：蘆丁在 0.021 1 ～0.422 0 μg，連翹酯苷 A 在0.015 3 ～0.306 0 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取混合對照品溶液10 μL，按照色譜條件進(jìn)行檢測，重復(fù)測定5次，記錄峰面積。結(jié)果：蘆丁和連翹酯苷 A的 RSD分別為1.21%、1.16%。結(jié)果表明：儀器精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次的連翹樣品粉末0.1 g，共5份，按照2.2項(xiàng)下供試品溶液的方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下檢測方法分析，記錄峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果：蘆丁和連翹酯苷 A的 RSD分別為1.52%、1.47%。結(jié)果表明：方法的重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取連翹細(xì)粉0.1 g，按照上述方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8，12，24 h后進(jìn)行檢測。結(jié)果：蘆丁和連翹酯苷A的RSD分別為1.35%、1.39%。結(jié)果表明：供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品粉末(批號為121009，蘆丁含量為2.54 mg/g，連翹酯苷A含量為4.88 mg/g)0.1 g共6份，分別精密加入用500 g/L甲醇配制的蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.1 mg/L和連翹酯苷A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.3 mg/L的混合對照品溶液20 mL，再精密加入500 g/L甲醇30 mL，其余按照供試品溶液制備方法項(xiàng)下方法操作，制備加樣回收率供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，根據(jù)測定的含量計(jì)算蘆丁和連翹酯苷A的回收率。結(jié)果見表1。

表1 連翹中蘆丁、連翹酯苷A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品分析測定

選擇連翹樣品3批，按照2.2方法項(xiàng)下制備供試品溶液，2.1項(xiàng)下方法測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果 n=3

3 小結(jié)

有關(guān)色譜條件的選擇：利用PDA檢測器在190～400 nm范圍內(nèi)不同檢測波長下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)329 nm下基線平穩(wěn)、干擾物質(zhì)少，兩成分具有較大吸收，因此選擇329nm為測定波長。在試驗(yàn)中，選擇了乙腈—水、甲醇—水及添加冰醋酸等不同流動相，乙腈、甲醇對分離沒有太大影響，考慮乙腈毒性較大，選擇甲醇作為有機(jī)相，水相中添加冰醋酸可以明顯改善峰型和分離度，最終選擇甲醇－冰醋酸溶液體系作為流動相。有關(guān)供試品溶液的制備：考察了甲醇、950 g/L乙醇、500 g/L甲醇對連翹中蘆丁和連翹酯苷 A提取效率的影響，結(jié)果表明：500 g/L甲醇提取最好。以500 g/L甲醇做溶劑，比較超聲和回流提取效果，超聲提取效率更高，提取時間更短，故確定供試品溶液的制備方法為連翹藥材用500 g/L甲醇超聲提取30 min。本文采用高效液相色譜法同時測定連翹中蘆丁和連翹酯苷A的含量，并測定了河南嵩縣樣品，該方法可靠穩(wěn)定，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，適合于連翹的質(zhì)量控制，為連翹藥材的質(zhì)量控制方法研究提供了參考。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：159－160.

［2］李倩，馮衛(wèi)生.連翹的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(2)：78 －80.

［3］張海燕.連翹化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2001，23(10)：657 －60.

［4］臧志和，曹麗萍，鐘鈴.蘆丁藥理作用及制劑的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，26(7)： 758 －760.

［5］靖會，李教社，曹蔚，等.高效液相色譜法測定連翹中連翹酯苷的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2003，18(4)：156 －157.