葉偉兵 趙琦 陳健媚
(廣州市荔灣區(qū)第二人民醫(yī)院,廣東 廣州510160)
板翹解毒顆粒劑是由我院制劑板翹解毒口服液經(jīng)劑型改良后制成,由板藍(lán)根、石膏、連翹、知母等組方而成,主要用于風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱、上呼吸道感染、腮腺炎及其他病毒感染。為提高制劑質(zhì)量,本研究采用薄層色譜法(TLC)對(duì)連翹、板藍(lán)根及知母進(jìn)行定性研究,并應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)建立制劑中連翹苷的含量測(cè)定方法。
高效液相色譜儀(HP1100,安捷倫);二極管陣列檢測(cè)器(安捷倫);定量毛細(xì)管(日本);硅膠G(青島海洋化工廠);連翹苷對(duì)照品(批號(hào):0821-9903,供含量測(cè)定用),連翹對(duì)照藥材(批號(hào):908-9908),板藍(lán)根對(duì)照藥材(批號(hào):177-200303),菝葜皂苷元(批號(hào):744-9904,供鑒別用),均購自原中國(guó)藥品生物制品檢定所;板翹解毒顆粒,自制,規(guī)格為10 g/袋,批號(hào):111231、120101、120102;陰性樣品(按處方工藝制得缺味樣品);乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。
取本品5 g,研細(xì),加稀乙醇20 mL,超聲處理(300 w,35 kHz)20 min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,作為供試品溶液。另取缺連翹陰性對(duì)照樣品5 g,同法制成陰性對(duì)照溶液。再取連翹對(duì)照藥材0.5 g,加稀乙醇 20 mL,超聲處理20 min,同法制成對(duì)照藥材溶液。分別吸取供試品溶液、缺連翹陰性對(duì)照溶液及對(duì)照藥材溶液各10 μL分別點(diǎn)于同一硅膠G板上,以三氯甲烷-甲醇(7∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以香草醛硫酸溶液,105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾,結(jié)果見圖1。
圖1 連翹TLC圖
取缺板藍(lán)根陰性對(duì)照5 g,研細(xì),按2.1項(xiàng)下同法制成陰性對(duì)照溶液;另取板藍(lán)根對(duì)照藥材1 g,按2.1項(xiàng)下同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取2.1項(xiàng)下制備的供試品溶液、缺板藍(lán)根陰性對(duì)照溶液及對(duì)照藥材溶液各10 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G板上,以正丁醇-無水乙酸-水(19∶5∶5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以茚三酮試液,105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾,結(jié)果見圖2。
圖2 板藍(lán)根TLC圖
取本品10 g,加溫水 20 mL,攪拌使溶解完全,加乙酸乙酯振搖提取 3次,每次20 mL,取水層溶液,加鹽酸3 mL,加熱回流1 h,放冷,濾過,濾液加三氯甲烷振搖提取3次,每次15 mL,合并三氯甲烷液,加氨試液洗滌2次,每次20 mL,再用水洗滌 3次,每次20 mL,取三氯甲烷液,水浴蒸干,殘?jiān)萌燃淄? mL溶解,作為供試品溶液。另取缺知母陰性對(duì)照10 g,同法制成陰性對(duì)照溶液,再取菝葜皂苷元對(duì)照品,加三氯甲烷制成每1 mL含3 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。分別吸取供試品溶液、缺知母陰性對(duì)照溶液及對(duì)照品溶液各 10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G板上,以苯-丙酮(9∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以香草醛硫酸溶液,105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性無干擾,結(jié)果見圖3。
圖3 知母TLC圖
2.4.1 色譜條件 色譜柱Kromasil 100-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈-水(22∶78),流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣量為20 μL,理論板數(shù)按連翹苷計(jì)算應(yīng)不低于3 000。
2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取連翹苷適量,用70%甲醇溶解并配制成每1 mL含100 μg的對(duì)照品溶液。
2.4.3 供試品溶液的制備[1-2]取本品5 g,精密稱定,加熱水20 mL,攪拌使完全溶解,加乙酸乙酯振搖提取6次,每次20 mL,合并乙酸乙酯液,水浴蒸干,殘?jiān)?0%甲醇溶解,置10 mL容量瓶中,加70%甲醇至刻度,搖勻,即得。取缺連翹陰性樣品,同法制備陰性對(duì)照溶液。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明陰性無干擾。見圖4。
圖4 對(duì)照品、陰性對(duì)照和板翹解毒顆粒HPLC圖
2.4.4 線性關(guān)系 分別精密吸取對(duì)照品溶液1,2,5,10,20,30,40 μL 注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件測(cè)定,測(cè)定結(jié)果以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo),以色譜峰面積Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:
Y=741.487X-9.228,r=0.999 9
線性范圍為 0.10~ 4.00 μg。
2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μL,重復(fù)進(jìn)樣 6次,測(cè)定峰面積,結(jié)果連翹苷峰面積的RSD為0.69%,表示儀器精密度良好。
2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液各20 μL,分別在 0,6,12,18,24 h 進(jìn)樣,按上述色譜條件測(cè)定峰面積,結(jié)果連翹苷峰面積的RSD為1.39%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。
2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)顆粒6份,每份5 g,精密稱定,按2.4.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測(cè)定峰面積并計(jì)算含量,結(jié)果連翹苷的平均含量為0.153 mg/g,RSD為1.82%,表明本法具有良好的重復(fù)性。
2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批號(hào)樣品(連翹苷含量 0.153 mg/g)6份,每份 2.5 g,精密稱定,再分別精密加入含連翹苷對(duì)照品水溶液(0.078 mg/mL)5 mL,按供試品溶液的制備及樣品的測(cè)定方法操作,結(jié)果見表1。
表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=2)
2.4.9 樣品的測(cè)定 取3批樣品,按供試品溶液制備方法制備溶液,進(jìn)樣測(cè)定含量。批號(hào)為111231,120101,120102的3批樣品中,連翹苷含量分別為0.153,0.143,0.144 mg/g。
連翹TLC鑒別展開劑曾嘗試三氯甲烷-甲醇(8∶1)、三氯甲烷-甲醇(7∶1)[2]及三氯甲烷-甲醇-無水乙酸(17∶2∶1)[3],最后確定采用三氯甲烷-甲醇(7∶1),并優(yōu)化了供試品溶液的制備方法。板藍(lán)根TLC鑒別展開劑采用文獻(xiàn)方法[2,4-5],確定了正丁醇-無水乙酸-水(19∶5∶5)。 知母展開劑采用文獻(xiàn)方法[2,6],確定了苯-丙酮(9∶1)。 結(jié)果顯示陰性對(duì)照均無干擾,專屬性較好。
連翹苷含量測(cè)定方法中,采用乙腈-水為流動(dòng)相,曾比較了多種比例的流動(dòng)相[1-2,7-8],結(jié)果乙腈-水為22∶78時(shí),連翹苷分離度較好,峰形尖銳且較對(duì)稱,不拖尾。該測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快速、可靠,適用于板翹解毒顆粒的質(zhì)量控制。
[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2010年版)一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:159.
[2] 劉柳花,侯惠嬋.板翹口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].今日藥學(xué),2010,20(7):21-23.
[3] 呂彬.清熱解毒口服液薄層鑒別的改進(jìn)[J].中成藥,2007,29(10):附 1-附 2.
[4] 鄭艷平,林壯民.藍(lán)菊抗病毒口服液的薄層鑒別[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,7(22):76-78.
[5] 王鋼力,張錚,聶黎行.三種板藍(lán)根制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中成藥,2009,31(10):1531-1535.
[6] 劉艷麗,姜燕,郭紅艷.暢中膠囊中大黃、知母的薄層色譜鑒別[J].中國(guó)藥業(yè),2010,19(13):28.
[7] 許紅輝,張永鋒,趙韶華,等.高效液相色譜法測(cè)定連梔膠囊中連翹苷和梔子苷含量[J].中國(guó)藥業(yè),2011,20(15):20-21.
[8] 裴香萍,張淑蓉,閆艷,等.不同采收期青翹中連翹苷、連翹酯苷和蘆丁的含量測(cè)定[J].中國(guó)藥事,2011,25(5):438-440.