姜 巖，施國新，陳 霖，汪鵬合，喬緒強，田秀麗

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點實驗室，南京210046)

Cu2+是植物生長發(fā)育必需的微量營養(yǎng)元素，但過量的Cu2+會對植物產(chǎn)生毒害［1-2］.Cu2+脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，對細胞膜、細胞結(jié)構(gòu)等造成傷害，導(dǎo)致細胞代謝紊亂［3］.多胺是一類高生物活性的脂肪族含氮堿，能促進植物的生長發(fā)育，延遲衰老，提高植物的抗逆性等［4］.有研究表明，外源多胺可以緩解Cu2+脅迫對水鱉的毒害癥狀［5］，提高Cu2+脅迫下荇菜葉片生物膜的保護作用［6］，但關(guān)于內(nèi)源多胺在植物體抵抗Cu2+脅迫方面的研究較少.目前研究中所采用的實驗材料大多為自然生長的植物，取材受季節(jié)限制，實驗結(jié)果易受植物生長環(huán)境的影響.鑒于此，本文以菹草無菌苗為實驗材料，研究了Cu2+脅迫對菹草無菌苗的抗氧化酶活性、產(chǎn)生速率、H2O2含量、MDA含量及可溶性蛋白含量的影響，并研究了Cu2+脅迫對菹草無菌苗內(nèi)源多胺代謝的影響，試圖探討菹草無菌苗內(nèi)源多胺在Cu2+脅迫逆境適應(yīng)中的變化及作用，并為進一步研究植物抗重金屬脅迫的生理生化機制提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實驗材料

菹草(Potamogeton crispus L.)為眼子菜科植物，多年生沉水草本，根狀莖細長，多分枝，側(cè)枝短，葉呈披針形.本次實驗所用菹草于2010年11月采自南京市琵琶湖水域，以菹草帶節(jié)間的幼嫩莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的無菌苗作為研究對象.

1.2 研究方法

1.2.1 菹草無菌苗的培養(yǎng) 選取菹草靠近頂端的幼嫩莖段作為外植體，用清水沖洗干凈，在無菌環(huán)境中依次經(jīng)過5%的H2O2消毒15 min，無菌水沖洗3次;10%次氯酸鈉消毒30s，無菌水沖洗5次后將菹草帶側(cè)芽的莖段剪成約8 mm長，接種于含6-BA(2.0 mg/L)和IBA(0.5 mg/L)的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分化;15 d左右莖間側(cè)芽約2 cm長，轉(zhuǎn)入含6-BA(2.0 mg/L)的MS繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)20 d;而后置于1/10的無菌Hoagland營養(yǎng)液中進行生根培養(yǎng)1個月以得到完整的無菌苗.整個組培過程在培養(yǎng)室進行，培養(yǎng)溫度為25℃，每天光照16 h，光照強度為1200～1500 lx.

1.2.2 Cu2+對菹草無菌苗的毒害處理 選取生長狀況一致的菹草無菌苗植株置于含0、1、2、4、8和12 μmol/L CuSO4(以純Cu2+計)的無菌1/10 Hoagland營養(yǎng)液(Cu2+濃度為32 nmol/L)中，每個處理設(shè)3次重復(fù)，置于與培養(yǎng)無菌苗環(huán)境一致的培養(yǎng)室中培養(yǎng).處理5 d后取菹草無菌苗完整植株，去離子水洗凈、揩干，進行各項生理指標(biāo)測定.

1.2.3 SOD、POD和CAT活性的測定 SOD活性測定采用NBT光化還原法［7］，以抑制NBT光還原50%所需的酶量為1個酶活性單位(U);POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚方法［8］，以每分鐘OD470的變化為1個酶活性單位(U);CAT活性測定采用鉬酸鹽方法［9］，以每分鐘分解1 μmol H2O2所需的酶量為1個酶活性單位(U).

1.2.5 可溶性蛋白含量的測定 可溶性蛋白含量用考馬斯亮藍G-250法［12］測定，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

1.2.6 多胺含量及其代謝酶的測定 多胺含量的測定采用Aziz等［13］的方法，以nmol/g(FW)表示;精氨酸脫羧酶(ADC)和鳥氨酸脫羧酶(ODC)的活性根據(jù)Zhao等［14］的方法測定，其活性分別以1 μmol Agm/h和1 μmol Put/min為1個酶活性單位(U)表示;多胺氧化酶(PAO)和二胺氧化酶(DAO)的活性測定參照汪天等［15］的方法，以0.001ΔOD550/min 為 1 個酶活性單位(U).

1.3 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Excel和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行制圖和統(tǒng)計分析.用相關(guān)系數(shù)(r)對各指標(biāo)與Cu2+濃度間進行相關(guān)性統(tǒng)計，P≥0.05表示無顯著相關(guān)性，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異.

2 實驗結(jié)果

2.1 Cu2+脅迫對菹草無菌苗SOD、POD、CAT活性的影響

隨著Cu2+濃度升高，SOD活性明顯被激活，表現(xiàn)為逐漸上升的趨勢，在Cu2+濃度為12 μmol/L時最大，為對照的 1.92倍;POD和CAT活性隨Cu2+濃度的升高均表現(xiàn)為先升后降，二者均在Cu2+濃度為1 μmol/L時達到峰值，分別為對照的3.97和2.52倍，后逐漸降低.相關(guān)性分析表明，SOD活性變化與Cu2+處理濃度間達到極顯著正相關(guān)(r=0.9796，P ＜0.01)(圖1).

圖1 Cu2+脅迫對菹草無菌苗POD、SOD和CAT活性的影響(不同字母代表差異顯著，下同)Fig.1 Effects of Cu2+stress on POD，SOD and CAT activities in aseptic seedlings of P.crispus

2.2 Cu2+脅迫對菹草無菌苗 產(chǎn)生速率、H2O2含量和MDA含量的影響

圖2 Cu2+脅迫對菹草無菌苗產(chǎn)生速率(A)和H2O2、MDA含量(B)的影響Fig.2 Effects of Cu2+stress on generation rate(A)，H2O2and MDA contents(B)in aseptic seedlings of P.crispus

2.3 Cu2+脅迫對菹草無菌苗可溶性蛋白含量的影響

隨著Cu2+濃度的升高，菹草無菌苗可溶性蛋白含量在短暫升高后迅速降低，在Cu2+濃度為12 μmol/L時最低，為對照的84.59%(圖3).

2.4 Cu2+脅迫對菹草無菌苗多胺含量的影響

2.4.1 游離態(tài)多胺含量的變化 隨著Cu2+濃度升高至2 μmol/L，菹草無菌苗游離態(tài)Put含量短暫上升至最大，為對照的1.45倍，后迅速降低;游離態(tài)Spd的含量則隨Cu2+濃度的升高逐漸降低，當(dāng)Cu2+濃度為12 μmol/L時，其含量僅為對照組的56.50%;游離態(tài)Spm的含量在Cu2+濃度為0～8 μmol/L時逐漸上升，在12 μmol/L時略有下降，但仍為對照組的1.46倍(圖4A);游離態(tài)(Spd+Spm)/Put的比值在Cu2+濃度為0～2 μmol/L時有所降低，之后隨著Cu2+濃度的升高迅速增大(圖4B).相關(guān)性分析表明，游離態(tài)Spd的含量變化與Cu2+濃度之間呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.8920，P ＜0.01).

圖3 Cu2+脅迫對菹草無菌苗可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of Cu2+stress on soluble protein content in aseptic seedlings of P.crispus

2.4.2 結(jié)合態(tài)多胺含量的變化 菹草無菌苗的結(jié)合態(tài)Put含量在Cu2+濃度為0～2 μmol/L時緩慢上升并在2 μmol/L時達到峰值，為對照組的1.17倍，后其含量迅速下降并顯著低于對照;隨著Cu2+濃度升高，結(jié)合態(tài)Spd的含量與對照組相比有所上升;結(jié)合態(tài)Spm含量隨Cu2+濃度的升高逐漸升高，當(dāng)Cu2+濃度為8 μmol/L時含量達到最大值，為對照組的1.87倍(圖4C).相關(guān)性分析表明，結(jié)合態(tài)Put含量變化與Cu2+處理濃度之間達到顯著負(fù)相關(guān)(r= －0.8478，P＜0.05);結(jié)合態(tài)Spm含量變化與Cu2+處理濃度之間呈極顯著正相關(guān)(r=0.9178，P ＜0.01).

2.4.3 束縛態(tài)多胺含量的變化 束縛態(tài)Put及Spd的含量均隨Cu2+濃度升高逐漸升高，分別在Cu2+濃度為4 μmol/L和2 μmol/L時達到峰值，分別為對照組的5.59和1.78倍，之后二者含量均降低，但仍高于對照;束縛態(tài)Spm的含量隨Cu2+濃度升高逐漸降低，當(dāng)Cu2+濃度為12 μmol/L時，其含量僅為對照組的4.49%(圖4D).

2.4.4 多胺總含量的變化 隨著Cu2+濃度升高，Put總含量呈先升后降的趨勢，在Cu2+濃度為2 μmol/L時達到最大值，為對照組的1.35倍，之后其含量迅速降低并低于對照;Spd的總含量隨著Cu2+濃度的升高逐漸降低，當(dāng)Cu2+濃度為12 μmol/L時，其含量最低，僅為對照組的68.03%;隨Cu2+濃度升高，Spm的總含量逐漸上升，在Cu2+濃度為8 μmol/L時達到峰值，為對照組的1.78倍，之后略有降低.相關(guān)性分析表明，Spd總含量變化與Cu2+處理濃度之間達到極顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.8748，P＜0.01);Spm總含量變化與Cu2+處理濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.8039，P ＜0.05)(圖4E).

2.5 Cu2+脅迫對菹草無菌苗ADC、ODC、PAO和DAO活性的影響

隨著Cu2+濃度升高，ADC的活性表現(xiàn)為先升后降，在Cu2+濃度為1 μmol/L時活性最大，為對照組的1.18倍，后其活性逐漸降低并低于對照;ODC活性隨著Cu2+濃度升高，變化不明顯;PAO和DAO的活性隨Cu2+濃度升高均表現(xiàn)為先升后降趨勢，分別在Cu2+濃度為4 μmol/L和1 μmol/L時達到峰值，之后酶活性下降，但均高于對照(圖5).相關(guān)性分析表明，PAO活性變化與Cu2+處理濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.7714，P ＜0.05).

3 討論

圖4 Cu2+脅迫對菹草無菌苗多胺含量的影響Fig.4 Effects of Cu2+stress on PAs content in aseptic seedlings of P.crispus

可溶性蛋白含量降低是植物重金屬脅迫的特征之一，本研究結(jié)果顯示，高濃度Cu2+脅迫導(dǎo)致菹草無菌苗可溶性蛋白含量迅速降低(圖3).這主要是因為:(1)Cu2+進入細胞后促進蛋白水解酶的活性，加強原有蛋白質(zhì)的分解［19］;(2)Cu2+對蛋白合成的眾多酶系均有毒害和抑制作用，并且使蛋白質(zhì)合成的相關(guān)細胞器受到損傷，抑制新蛋白的合成［20］.

多胺可以參與植物對逆境的響應(yīng)，在清除活性氧自由基、維持生物膜穩(wěn)定性等方面具有重要作用［21］.多胺的代謝特征之一是植物受到逆境脅迫時，體內(nèi)多胺含量迅速發(fā)生變化，并且不同種類、不同形態(tài)的多胺可以相互轉(zhuǎn)化［22］.多胺的氨基化程度越高，氨基數(shù)目越多，清除自由基的效果越好，因此三胺、四胺清除自由基的能力大于二胺，也就是說Spd和Spm清除自由基的能力要大于Put［23］.相關(guān)研究表明，游離態(tài)(Spd+Spm)/Put的升高有利于植物抵抗重金屬脅迫［24］.本研究結(jié)果表明，在高濃度Cu2+脅迫時，游離態(tài)(Spd+Spm)/Put迅速增大(圖4B)，這可能是因為游離態(tài)Put向Spd和Spm發(fā)生轉(zhuǎn)化，對增強菹草無菌苗抵抗Cu2+脅迫有重要的作用.

圖5 Cu2+脅迫對菹草無菌苗ADC、ODC(A)，PAO、DAO(B)活性的影響Fig.5 Effects of Cu2+stress on ADC，ODC(A)，PAO，DAO(B)activities in aseptic seedlings of P.crispus

研究表明，游離態(tài)多胺可以向結(jié)合態(tài)和束縛態(tài)多胺轉(zhuǎn)化，結(jié)合態(tài)多胺能形成分子屏障、抵御外界不良因素的侵染，束縛態(tài)多胺則可通過大分子的交聯(lián)穩(wěn)定細胞內(nèi)成分，結(jié)合態(tài)和束縛態(tài)多胺含量的增加可以增強植物抵抗脅迫的能力［25］.本研究結(jié)果顯示，低濃度Cu2+脅迫時，結(jié)合態(tài)多胺含量均有所上升，可能是游離態(tài)多胺向結(jié)合態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，之后隨著脅迫作用的加強，結(jié)合態(tài)Spd和Spm有所積累(圖4C)，較高含量的結(jié)合態(tài)Spd和Spm有利于菹草無菌苗抵御Cu2+脅迫.在較低濃度Cu2+脅迫時，束縛態(tài)Put和Spd含量上升，隨著Cu2+濃度進一步增大，束縛態(tài)Put含量迅速降低，而束縛態(tài)Spd含量變化平緩，可能是Put向Spd發(fā)生了轉(zhuǎn)化，但二者含量仍高于對照(圖4D).由于束縛態(tài)Put和Spd是束縛態(tài)多胺的主要成分，在脅迫期間，維持較高的束縛態(tài)Put和Spd含量，有利于穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)［23，26］，提高菹草無菌苗的抗逆性.而束縛態(tài)Spm含量(圖4D)隨Cu2+濃度升高迅速降低，可能是向結(jié)合態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，也說明其對Cu2+脅迫比較敏感.

植物合成Put有兩條途徑，一是精氨酸(Arg)在ADC的作用下脫羧，生成鯡精胺(Agm)，再脫去一分子氨生成Put;二是精氨酸(Arg)先脫去一分子脲，生成鳥氨酸(Orn)，然后經(jīng)ODC催化生成Put.汪沛洪［27］認(rèn)為在滲透脅迫條件下，Put含量的上升是由于脅迫導(dǎo)致了ADC活性的上升，ODC則不參與反應(yīng).本實驗中，處理后，在低濃度Cu2+脅迫時ADC活性受到激發(fā)，逐漸上升，之后隨著Cu2+脅迫的進一步加深，其活性下降并低于對照，但ODC活性變化不明顯(圖5A)，說明Put的ADC生物合成途徑與菹草無菌苗對Cu2+脅迫的反應(yīng)有關(guān).Put的降解酶DAO活性隨Cu2+濃度升高表現(xiàn)與ADC相同，均為先升后降，但DAO活性均高于對照組(圖5B)，可能是Put快速合成，并作為底物激活DAO，使其氧化活性增強，從而反饋調(diào)節(jié)Put.PAO是催化生物體內(nèi)多胺降解的關(guān)鍵酶，其通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多胺的水平和生成物濃度，參與植物體對各種逆境脅迫的反應(yīng)和生長發(fā)育過程［28］.本研究表明，隨著Cu2+濃度升高，PAO活性逐漸升高，后有所降低但仍明顯高于對照組(圖5B)，這可能是因為Spm含量的升高誘導(dǎo)了PAO活性的同步升高，進而維持多胺代謝平衡.Spd在PAO的降解作用下，其含量隨著Cu2+濃度的升高逐漸下降.而Spm含量升高可能是菹草無菌苗抵抗Cu2+脅迫的信號之一，是對脅迫傷害的一種適應(yīng)性反應(yīng)，提高了菹草無菌苗抗脅迫的能力.

綜上所述，在Cu2+脅迫下，菹草無菌苗活性氧積累，膜脂過氧化程度增大，可溶性蛋白含量降低，表現(xiàn)出明顯的氧化脅迫.在一定Cu2+脅迫濃度范圍內(nèi)，菹草無菌苗抗氧化酶活性的升高，Spm含量的增大，Put向Spd和Spm的轉(zhuǎn)化以及不同狀態(tài)多胺之間的轉(zhuǎn)化，在一定程度上有利于降低活性氧對植物體的破壞，穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)，提高菹草無菌苗抵抗Cu2+脅迫的能力.

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