白金燕 馬福祥 賀蘭 金燕

(陜西師范大學化學化工學院 陜西西安 710062)

為了培養(yǎng)本科生的實踐能力與探索新知的精神，在基礎分析化學實驗中增設了研究型實驗，讓學生根據(jù)自己的興趣選擇指導教師，開展研究工作。目前環(huán)境污染和食品安全方面的問題引起大家的廣泛關注，學生對于利用所學知識進行環(huán)境污染監(jiān)測也非常感興趣。鉛在工業(yè)中的用途很廣，同時鉛在自然界中普遍存在，又因為其具有不可降解性和生物富集效應，故易導致鉛污染。鉛能作用于人的全身系統(tǒng)和器官，危及神經(jīng)、消化器官、心血管、腎臟等[1-4]。因此，建立簡單、靈敏、快速檢測鉛離子的方法，對食品安全和環(huán)境監(jiān)測有重要意義。在查閱文獻的基礎上，我們設計了利用熒光探針與DNA作用導致熒光信號改變檢測水樣中鉛離子的實驗。該實驗有助于學生了解科學研究工作的基本過程，培養(yǎng)學生查閱、歸納總結文獻的能力，分析與解決問題的能力，數(shù)據(jù)分析能力及科技論文寫作能力。

1 實驗原理

結晶紫屬于三苯甲烷類染料，分子內(nèi)容易發(fā)生電荷轉移，導致平面結構發(fā)生扭曲，光活性降低。結晶紫本身熒光信號很弱，而當結晶紫與單鏈凝血酶DNA適體混合后，其熒光信號將有所增強。在鉛離子存在條件下，單鏈凝血酶DNA適體發(fā)生構型改變，形成四鏈體DNA，可導致體系的熒光信號顯著增強。利用這種基于結晶紫與不同結構的凝血酶適體作用方式的差異而引起的熒光信號的改變，可實現(xiàn)對鉛離子含量的檢測。

2 試劑與儀器

2.1 儀器

PB-10pH計，電子分析天平，Hitachi F-7000熒光分光光度計。

2.2 試劑

凝血酶適體(5′-GGT TGG TGT GGT TGG-3′，簡稱TBA)由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。三羥甲基氨基甲烷、醋酸、結晶紫(crystal violet，簡稱CV)、Pb(NO3)2、KNO3、AgNO3、Cd(NO3)2、Ca(NO3)2、Mg(NO3)2、Zn(NO3)2、Al(NO3)3、Fe(NO3)3、NaF、乙腈(CH3CN)、抗壞血酸(Vc)、三乙醇胺(TEA)、乙二胺(EDA)都為分析純。配制濃度為1mmol/L的結晶紫溶液，10mmol/L Tris-acetate緩沖溶液(pH分別為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0)，溶劑均為超純水。用10mmol/L Tris-acetate(pH 7.0)緩沖溶液配制凝血酶適體的儲備液，濃度為25μmol/L。

3 實驗方法

將一定量10μmol/L的結晶紫溶液加入微量熒光比色皿中，檢測其熒光信號。將10μmol/L結晶紫與5μmol/L凝血酶適體混合，作用半小時，取一定量加入到微量熒光比色皿中，檢測熒光信號。然后加入不同濃度的Pb2+，每次加量為1μL，使其最終濃度分別為50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1μmol/L、5μmol/L，混合均勻，進行光譜掃描，觀察熒光光譜的變化。激發(fā)波長Ex=590nm，掃描范圍610～750nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為10nm，光電倍增管電壓為950V。

4 結果與討論

4.1 凝血酶適體與結晶紫濃度比的選擇

4.2 作用時間的考察

將10μmol/L結晶紫與5μmol/L凝血酶適體混合，每隔5分鐘檢測一次熒光強度。作用半小時后,加入5μmol/L Pb2+并混合均勻，再每隔5分鐘檢測一次熒光強度，以考察凝血酶適體與結晶紫作用時間及Pb2+的響應時間。實驗結果顯示在反應初期，隨著時間的增加，熒光強度逐漸增大，說明與結晶紫結合的凝血酶適體的量逐漸增加。反應30分鐘后，體系的熒光強度趨于穩(wěn)定，所以在檢測前需先將凝血酶適體與結晶紫培育30min，然后再加入Pb2+。結果表明，加入Pb2+后，體系的熒光強度將發(fā)生變化；至加入Pb2+10 分鐘后，體系的熒光強度基本不再改變。故確定鉛的作用時間為10分鐘。

4.3 pH的選擇

在10mmol/L Tris-acetate，pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0緩沖溶液中檢測5μmol/L Pb2+和5μmol/L凝血酶適體、10μmol/L結晶紫的熒光強度，選出凝血酶適體與結晶紫作用的最佳pH。實驗結果表明，當pH為7.0時，體系的熒光強度的變化最明顯，因此，我們選擇pH為7.0的10mmol/L Tris-acetate緩沖溶液為反應介質。

4.4 工作曲線及線性范圍

在Pb2+濃度為1nmol/L～10μmol/L范圍內(nèi)，lg[Pb2+]與熒光強度的變化(F0-F)/F0呈線性關系，線性方程為y=0.99+0.11x，線性相關系數(shù)R=0.992；信噪比為3時，檢測限為5×10-10mol/L。此方法的線性范圍較寬，檢測限低，基本上能夠滿足對于食品或環(huán)境中鉛和汞污染的監(jiān)測。

4.5 干擾離子的考察

由于多種離子都會誘導凝血酶適體與結晶紫發(fā)生構型改變，為了準確檢驗鉛離子，希望該方法只對Pb2+響應，這就需要使用掩蔽劑來掩蔽其他離子對實驗的干擾。我們在實驗中使用了4種掩蔽劑(38μmol/L乙腈，1.72mmol/L抗壞血酸，20μmol/L三乙醇胺，1.72mmol/L氟化鈉)，在最佳實驗條件下，進行了選擇性實驗，取Na+和K+濃度為20μmol/L，其他金屬離子濃度均為5μmol/L。結果表明，這4種掩蔽劑基本上不影響Pb2+反應。當選擇20μmol/L三乙醇胺和1.72mmol/L抗壞血酸作掩蔽劑時，可以將其他金屬離子的干擾降到最小。即在合適掩蔽劑存在的條件下，該方法對Pb2+具有較好的選擇性。

4.6 實際樣品的測定

采用我們設計的方法測定了自來水和湖水樣品中的Pb2+。對于自來水，要打開水管放水20min后收集，煮沸5min以去除氯。湖水用0.2μm過濾膜過濾掉雜質，再煮沸5min以去除氯。通過實驗，我們發(fā)現(xiàn)該方法與標準方法無顯著性差異，結果令人比較滿意(表1)。

表1 兩種測Pb2+方法比較

表中數(shù)據(jù)為5次測定結果的平均值±標準偏差。

以上結果表明，我們建立的方法簡單易行，在適當?shù)难诒蝿┫逻x擇性好、靈敏度高、檢測限低、成本低廉、操作簡便。傳統(tǒng)的鉛離子檢測方法有原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、示波極譜法等，這些方法具有設備昂貴、耗時、方法繁瑣等缺點，有的甚至使用了劇毒試劑，對實驗人員危害比較大。因此，發(fā)展測試方法簡單、操作簡便、現(xiàn)象直觀、成本低廉、試劑無毒或低毒的測定方法很有意義。

5 教學效果討論

本文介紹了一個能體現(xiàn)學科交叉研究特點的研究型實驗。學生在完成實驗過程中，不僅要應用化學分析和儀器分析的理論知識，而且還能學習到核酸的基本性質及樣品處理技術。學生在大量查閱文獻的基礎上，在教師的指導下，運用自己所學的理論知識，完成了實驗方案的設計。在實驗完成過程中，對實驗細節(jié)的把握、異常問題的解決、數(shù)據(jù)的分析整理，都有助于鍛煉學生的實踐能力，經(jīng)歷理論付諸實踐的過程；同時，學生也能從中體會到主動獲得新知的樂趣，激發(fā)進行科學研究的興趣和信心。此實驗在陜西師范大學已開設兩年，教學效果良好。

參 考 文 獻

[1] Foster W G,McMahon A,Rice D C.ToxicolIndHealth,1996,12:723

[2] Loghman-Adman M.HealthPerspect,1997,105:928

[3] Ronis M J,Badger T M,Shema S T,etal.ToxicolEnvironHealth,1998,53:327

[4] He L,Poblenz A T.JBiolChem,2000,275:12175