莫 娟，鄒 凱，肖志翔，李冠華，丁文兵，李有志

（(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.邵陽(yáng)縣煙草公司，湖南 邵陽(yáng)422100；3.湖南省農(nóng)業(yè)廳，湖南 長(zhǎng)沙410005）

灰毛豆（Tephrosia purpurea）為豆科灰毛豆屬 植物，又名野青樹(shù)等。該植物主要分布于東南亞等國(guó)和中國(guó)的福建、海南、廣東、廣西、云南、湖南等地。在巴基斯坦，該植物是一種傳統(tǒng)草藥植物，常作為利尿劑和通便劑使用[1]。國(guó)外曾從醫(yī)用的角度研究了該植物地上部分乙醇提取物對(duì)老鼠免疫功能的影響[2]，并從灰毛豆種子和根中分離出幾個(gè)黃酮類(lèi)化合物[3-4]；李有志等[5]曾報(bào)道該植物甲醇提取物對(duì)多種害蟲(chóng)具有毒殺活性，并分離鑒定了該植物樹(shù)皮中的主要?dú)⑾x(chóng)成分[6]。此后，李冠華等[7-8]又進(jìn)一步研究了該植物種子甲醇提取物對(duì)白背飛虱和谷蠹的毒殺活性，并報(bào)道該植物種子中的殺蟲(chóng)成分及其殺蟲(chóng)活性[9]。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)研究所已利用該植物中主要?dú)⑾x(chóng)成分開(kāi)發(fā)植物源殺蟲(chóng)劑10%12α-羥基魚(yú)藤酮EC，現(xiàn)已大面積推廣使用[10]。試驗(yàn)研究了灰毛豆不同品種樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量、含量與生長(zhǎng)期的關(guān)系以及不同生態(tài)條件和施肥措施對(duì)灰毛豆樹(shù)皮中該化合物含量的影響，以期為該殺蟲(chóng)植物的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

從海南、廣西、廣東、湖南和江西等地采集16個(gè)野生灰毛豆品種的種子。試驗(yàn)中所用肥料尿素、硫酸鉀和磷酸氫鈣均從試驗(yàn)點(diǎn)附近農(nóng)資市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)。液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Triple Quad LC/MS/MS，美國(guó)Agilent公司，6410B）；ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm，美國(guó)Agilent公司）；Eclipse XDB C18（4.6 mm×150 mm，5.0 μm，美國(guó)Agilent公司）和ZORBAX Extend-C18（2.1 mm×100 mm，3.5μm，美國(guó)Agilent公司）；氮吹儀（Organomation Associate）；十二孔固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；佛羅里硅土（Florisil）固相萃取柱（1 g/6mL）（美國(guó)Sepax公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）12α-羥基魚(yú)藤酮含量的檢測(cè)。提取方法同相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]，12α-羥基魚(yú)藤酮含量檢測(cè)采用王蘇寧[11]建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)。

（2）灰毛豆不同品種樹(shù)皮中12-a羥基魚(yú)藤酮含量的檢測(cè)。在2011年1月初分別在廣東、廣西、湖南、江西等16個(gè)野生灰毛豆品種采集地播種，待其苗出土后用標(biāo)簽標(biāo)記播種時(shí)間，分別于2011年和2012年的11月中旬采集該植物樹(shù)皮，陰干、粉碎后供12α-羥基魚(yú)藤酮含量檢測(cè)。其提取、檢測(cè)方法見(jiàn)（1）。

（3）不同樹(shù)齡灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮含量的檢測(cè)。在湖南省江華縣大石橋鄉(xiāng)種植收集的16個(gè)野生灰毛豆品種（圖1），于2011年1月初播種，僅保留出苗時(shí)間在2011年1月10日至2011年1月15日間的樹(shù)苗，并用標(biāo)簽標(biāo)明每棵樹(shù)苗的出苗時(shí)間及品種名稱。從樹(shù)苗苗齡8個(gè)月開(kāi)始于每月的25日收集不同品種的樹(shù)皮，將其陰干后供檢測(cè)樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量。其提取、檢測(cè)方法同（1）。

（4）施用不同肥料對(duì)灰毛豆中12α-羥基魚(yú)藤酮含量及產(chǎn)量的影響?；颐狗N植地點(diǎn)為湖南省江華縣大石橋鄉(xiāng)，土地為當(dāng)?shù)囟嗄攴N植水稻的稻田，灰毛豆選擇地方品種廣西2號(hào)。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，即尿素5 kg/667m2、硫酸鉀5 kg/667m2、磷酸氫鈣20 kg/667m2和空白對(duì)照（完全不使用前述3種肥料），采用完全隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)4次。每小區(qū)面積25 m2，小區(qū)間挖25 cm深的排水溝，所用肥料在平整土地時(shí)作為基肥使用。2012年1月17日播種，待灰毛豆樹(shù)苗株高約20 cm后間苗，保留有效苗數(shù)量為20株/m2，分布較均勻，2012年11月9日采收灰毛豆樹(shù)苗地上部分枝條（離地面約3cm處砍斷），分別收集各小區(qū)灰毛豆地上部分并將其陰干，除掉葉片后稱重，分別統(tǒng)計(jì)不同小區(qū)灰毛豆地上部分莖干枝條的生物量（干重）。按方法（1）粉碎、提取、檢測(cè)提取物中的12α-羥基魚(yú)藤酮，計(jì)算不同處理中12α-羥基魚(yú)藤酮的產(chǎn)量。

（5）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[12]軟件（Version 9.5）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)分析中百分比數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦平方根轉(zhuǎn)換，均值差異顯著性通過(guò)Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種灰毛豆樹(shù)皮中12-a羥基魚(yú)藤酮的含量

從表1中看出，一年樹(shù)齡的灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮含量在0.22%～5.95%之間，不同品種灰毛豆樹(shù)皮中該化合物含量差異顯著（P<0.05），含量最高的是廣西2號(hào)（5.95%），其次是海南1號(hào)（3.09%）；兩年樹(shù)齡的灰毛豆樹(shù)皮中該化合物含量在0.23%～6.01%之間，含量最高的仍然是廣西2號(hào)（6.01%），其次是海南1號(hào)（3.16%）。這表明，不同品種樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量差異較大。

2.2 不同樹(shù)齡灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量

16個(gè)灰毛豆地方品種不同樹(shù)齡樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量變化如圖1。這些品種樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量呈現(xiàn)相同的規(guī)律，當(dāng)樹(shù)齡11月內(nèi)時(shí)，樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量逐漸升高，在11月樹(shù)齡樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量接近最高值，此后樹(shù)皮中該化合物的含量基本穩(wěn)定。在這16個(gè)地方品種中，廣西2號(hào)中的12α-羥基魚(yú)藤酮的含量最高，其次是廣西3號(hào)。進(jìn)一步的方差分析結(jié)果表明，廣西2號(hào)樹(shù)皮中該化合物的含量遠(yuǎn)高于其它地方品種樹(shù)皮中的含量（P<0.01）。

表1 灰毛豆不同品種樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量（%）

圖1 16個(gè)灰毛豆品種不同樹(shù)齡樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量

2.3 不同肥料對(duì)灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮含量及產(chǎn)量的影響

從不同處理對(duì)灰毛豆地上部分的生物量來(lái)看，施用不同肥料對(duì)灰毛豆地上部分生物量有顯著的影響（表2），3個(gè)處理的生物量均顯著高于對(duì)照（P<0.05），其中施用肥料磷酸氫鈣后的地上部分生物量最高。由此可見(jiàn)，施用這3種肥料均可提高該植物地上部分的生物量。從施用不同肥料對(duì)該植物樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮含量的影響來(lái)看，施用磷酸氫鈣后樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量顯著高于另外兩個(gè)處理和對(duì)照組中該化合物的含量，而施用尿素和硫酸鉀后，樹(shù)皮中該化合物的含量和對(duì)照組中的含量差異不顯著（P＞0.05），可見(jiàn)施用磷酸氫鈣能顯著提高該植物樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量。從施用不同肥料對(duì)12α-羥基魚(yú)藤酮產(chǎn)量的影響來(lái)看，不同處理間12α-羥基魚(yú)藤酮的產(chǎn)量差異顯著，3個(gè)肥料處理中12α-羥基魚(yú)藤酮的產(chǎn)量均顯著高于空白對(duì)照組中該化合物的含量（P<0.05）。施用磷酸氫鈣、尿素和硫酸鉀處理后，該化合 物 的 產(chǎn) 量 依 次 是75.33、66.34、64.26 kg/667m2（表2），可見(jiàn)這3種肥料均能顯著提高12α-羥基魚(yú)藤酮的產(chǎn)量，其中提高幅度最大的是磷酸氫鈣。

表2 不同施肥處理對(duì)灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮含量及產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 小結(jié)

不同品種樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量差異較大，廣西2號(hào)品種是一種適宜在湖南江華推廣種植的殺蟲(chóng)資源植物，其最佳采收時(shí)期為11月；施用磷酸氫鈣有利于提高該植物中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量和產(chǎn)量。

3.2 討論

（1）適宜推廣種植的灰毛豆品種及最佳采收期。植物中次生代謝產(chǎn)物含量除與該植物遺傳基礎(chǔ)有關(guān)外，通常還受生長(zhǎng)地生態(tài)條件和采集時(shí)間的影響，不同地點(diǎn)采集的同種植物中各化合物的含量可能不同[13]。16個(gè)灰毛豆品種樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量不同，這表明不同品種的遺傳基礎(chǔ)確實(shí)存在差異。研究結(jié)果還表明，灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量也與生長(zhǎng)地的生態(tài)條件有關(guān)，如品種海南1號(hào)種植在江華和原產(chǎn)地海南時(shí)，樹(shù)齡為11個(gè)月時(shí)樹(shù)皮中該化合物的含量分別是2.03%和3.09%，兩者間差異顯著（t測(cè)驗(yàn)，P<0.05）。這表明，在開(kāi)發(fā)利用殺蟲(chóng)植物灰毛豆時(shí)，應(yīng)先試種，確定最佳品種后方可大規(guī)模種植。

廣西2號(hào)不論是在原產(chǎn)地海南，還是在被引種到湖南江華種植，樹(shù)皮中該化合物的含量均顯著高于其他品種樹(shù)皮中的含量?？梢?jiàn)，從開(kāi)發(fā)利用該植物樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的角度而言，廣西2號(hào)是一種適宜在湖南江華推廣種植的灰毛豆品種。

灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量與灰毛豆的樹(shù)齡密切相關(guān)，當(dāng)樹(shù)齡在11個(gè)月以前，樹(shù)皮中該化合物的含量升高較快；在11個(gè)月后，樹(shù)皮中該化合物的含量趨于穩(wěn)定。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，湖南江華1月人工種植灰毛豆的最佳采集時(shí)間為11月，此時(shí)該植物樹(shù)皮中的12α-羥基魚(yú)藤酮的含量已趨向穩(wěn)定，接近最高值。

（2）栽培措施對(duì)灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮含量及產(chǎn)量的影響。原材料供應(yīng)不足以及植物材料中活性成分含量低等，是當(dāng)前制約植物源殺蟲(chóng)劑產(chǎn)業(yè)化的重要因素之一。人工種植殺蟲(chóng)植物是緩解原材料供應(yīng)不足的主動(dòng)措施，是獲得優(yōu)質(zhì)原材料的重要途徑。在人工種植過(guò)程中如何通過(guò)栽培管理措施調(diào)控目標(biāo)產(chǎn)物向高產(chǎn)方向發(fā)展，是灰毛豆栽培過(guò)程中值得研究的問(wèn)題。研究結(jié)果表明，盡管灰毛豆樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量受其遺傳基礎(chǔ)決定，但通過(guò)施肥措施可提高該化合物的產(chǎn)量，施用磷酸氫鈣可以提高該植物地上部分的生物量，更重要的是可顯著提高樹(shù)皮中12α-羥基魚(yú)藤酮的含量，大幅度地提高該化合物的產(chǎn)量，這對(duì)開(kāi)發(fā)12α-羥基魚(yú)藤酮植物源殺蟲(chóng)劑來(lái)說(shuō)具有重要意義。迄今為止，尚無(wú)通過(guò)施肥措施提高該植物中代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道，有關(guān)施用磷酸氫鈣提高12α-羥基魚(yú)藤酮含量的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。為促進(jìn)利用該植物開(kāi)發(fā)植物源殺蟲(chóng)劑12α-羥基魚(yú)藤酮，探討如何通過(guò)合理密植、加強(qiáng)肥水管理來(lái)提高該植物中12α-羥基魚(yú)藤酮的產(chǎn)量，規(guī)范灰毛豆的人工栽培措施是值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

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