彭佳麗，胡國良，王小鶯，郭小權(quán)，曹華斌，胡小明

（1．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌330045；2．江西省余江縣畜牧獸醫(yī)局，江西 余江335200）

脂肪肝綜合征是一種脂類代謝紊亂疾病，以肝臟脂肪過度沉積或伴有肝臟出血為特征，發(fā)生率與遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌、激素的影響，有毒物質(zhì)等因素有關(guān)。殼聚糖是甲殼質(zhì)經(jīng)脫乙酰反應(yīng)后的產(chǎn)品，屬于氨基多糖，被譽(yù)為生命要素之一，與機(jī)體之間有良好的生物相容性，并且具有多種藥理作用，提高機(jī)體免疫力，抗腫瘤，抗氧化，抗自由基。中醫(yī)治療脂肪肝主要以化痰祛濕、活血化癖、疏肝解郁、健脾消導(dǎo)為主，同時(shí)輔以清熱解毒、利膽化積、補(bǔ)腎養(yǎng)肝等方法［1］。本試驗(yàn)將殼聚糖合并中藥，以常用藥氯化膽堿為對(duì)照藥物，研究復(fù)方殼聚糖中藥制劑對(duì)蛋雞脂肪肝的治療效果及作用機(jī)理，為中藥應(yīng)用于臨床降低脂肪肝發(fā)病率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物 海褐藍(lán)蛋雞280日齡120羽，平均體重1．5kg±0．25kg（購自江西九江某種雞場）。雞只飼養(yǎng)環(huán)境相同，自由采食和飲水，16h光照。

1．2 試驗(yàn)藥物及試劑 殼聚糖（水溶性，脫乙酰度90%，購自青島云宙生化有限公司），氯化膽堿（含量：50%，購自南昌獸藥店），復(fù)方中藥（柴胡15g、黃芩9g、芍藥9g、生姜15g、大黃6g等，購自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院）。殼聚糖復(fù)方制劑的配制：中藥濃縮至每1mL含生藥0．5g的溶液，合并殼聚糖0．5g（殼聚糖的量按飼料的1%添加）混合配制，4℃冰箱保存（3d內(nèi)用完）。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），乳酸脫氫酶（LDH）、脂蛋白酯酶（LPL）試劑盒由南京建成生化試劑廠生產(chǎn)。

1．3 飼料配方 對(duì)照組日糧參照美國NRC（1998）蛋雞營養(yǎng)需要配合而成；試驗(yàn)組日糧除了能量、蛋白含量外，其他營養(yǎng)需要均參照美國NRC（1998）蛋雞營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配合而成。配方及營養(yǎng)水平見表1（配方一：基礎(chǔ)日糧；配方二：高能低蛋白日糧）。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧構(gòu)成

預(yù)混料配方：蛋雞用多維299．10mg，銅4．95mg，鐵31．30mg，錳41．21mg，鋅42．04mg，碘0．61mg，硒0．15mg，沸石粉2465．28 mg，蛋氨酸997．01mg，桿菌鈦鋅39．93mg，抗氧喹164．5mg，膽堿448．65mg，糠3489．53mg

2 方法

2．1 蛋雞脂肪肝綜合征病理模型的建立 獸醫(yī)臨床上，一般對(duì)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽堿酯酶等肝臟特異性酶的檢驗(yàn)來進(jìn)行肝臟疾病診斷［2］。組織學(xué)上每單位面積有三分之一以上的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，亦可判定為脂肪肝。本試驗(yàn)采用高能低蛋白飼料飼喂，通過酶學(xué)診斷和病理切片來判定蛋雞脂肪肝造模是否成功。雞只適應(yīng)環(huán)境1周后，將蛋雞分為四組：A組飼喂基礎(chǔ)日糧（配方一），B、C、D組飼喂高能低蛋白日糧（配方二），飼喂45d。

2．2 殼聚糖復(fù)方制劑對(duì)雞脂肪肝綜合征的療效試驗(yàn)造模成功后，開始治療試驗(yàn)。記錄試驗(yàn)過程中各組雞精神、發(fā)病和死亡情況。A組飼喂配方一日糧，B組繼續(xù)飼喂配方二飼料；C組在飼喂配方二的基礎(chǔ)上，飲水中添加殼聚糖復(fù)方制劑溶液2mL／只雞；D組在飼喂配方二的基礎(chǔ)上，添加氯化膽堿，劑量為2 g／kg飼料。在給藥15d、30d取每組抽取6只雞，頸靜脈采血后剖殺，，取血液和肝臟勻漿測定生化指標(biāo)，觀察并記錄各器官組織的肉眼變化。生化指標(biāo)測定方法按照試劑盒說明書步驟嚴(yán)格規(guī)范執(zhí)行。

2．3 血清樣品采集 屠宰前禁食12h，心臟采血10mL，試管分裝，先放入生化培養(yǎng)箱中1h，然后放入4℃冰箱3h，析出血清，離心分裝于eppendorf管中，置－4℃ 冰箱保存。

2．4 勻漿制備 分別取同一部位肝臟樣品30g左右，包于封口袋，液氮冷凍，置－80℃冰箱保存。切取部分肝臟，按1∶9的重量體積比加入生理鹽水，勻漿后，于2 500r／min離心10min，取上清液測定。

2．5 病理學(xué)觀察 將固定于10%福爾馬林的組織塊，于72h后取適宜大小肝臟做常規(guī)石蠟包埋，H．E．染色，光鏡觀察并記錄病理組織學(xué)變化。

2．6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均以（平均值X±標(biāo)準(zhǔn)誤SE）形式表示，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件單因素方差分析組間差異顯著性，進(jìn)行各組間均數(shù)的多重比較。

3 結(jié)果

3．1 蛋雞脂肪肝綜合征病理模型的建立

3．1．1 酶學(xué)檢測 試驗(yàn)第45天，A組與B組、C組、D組的ALT、AST活力差異顯著（P＜0．05），B、C、D組ALT、AST活力明顯升高，結(jié)合病理學(xué)變化，確定造模成功。

表3 高能低蛋白飼料對(duì)蛋雞AST和ALT的影響

3．1．2 病理學(xué)觀察 試驗(yàn)第45天，剖檢雞只，A組肝臟未見異常，色澤紫紅，腹腔脂肪及腸系膜等處可見少量脂肪，B組、C組、D組肝臟腫大呈淡黃色或黃褐色，嚴(yán)重者肝臟破裂出血、質(zhì)脆，用刀切時(shí)，刀面有脂滴附著，切面外翻，腹下、皮下、心包、胃及腸系膜均有大量脂肪沉積，膽囊腫大，膽汁充盈。從組織學(xué)變化來看，試驗(yàn)第45天，對(duì)照A組肝細(xì)胞大小、形狀都比較正常，未見脂肪空泡、腫大變性現(xiàn)象，排列整齊，B、C、D三組肝細(xì)胞均有少量壞死，細(xì)胞腫大，胞核擠向一側(cè)，且細(xì)胞內(nèi)均有大小不一，數(shù)量不等的脂肪空泡，肝索和肝竇的結(jié)構(gòu)不清晰。

3．2 殼聚糖復(fù)方制劑對(duì)雞脂肪肝綜合征的療效試驗(yàn)

3．2．1 殼聚糖復(fù)方制劑對(duì)肝臟乳酸脫氫酶（LDH）活力的影響 給藥15d，B組活力明顯高于A組、C組、D組，差異均顯著（P＜0．05），C組、D組活力差異不顯著（P＞0．05）；給藥30d，B組與 A組、C組、D組差異顯著，說明隨著治療時(shí)間的延長，殼聚糖復(fù)方制劑對(duì)肝臟LDH活力的抑制作用更加明顯。

表6 乳酸脫氫酶（LDH）活力 （U／L）

3．2．2 殼聚糖復(fù)方制劑對(duì)肝臟脂蛋白酯酶（LPL）活力的影響 給藥15d，B組與C組、D組差異顯著（P＜0．05），添加殼聚糖復(fù)方制劑后，C組LPL活力顯著升高。給藥30d，B組與C組差異顯著（P＜0．05），與健康A(chǔ)組差異不顯著（P＞0．05），并且殼聚糖復(fù)方制劑治療效果優(yōu)于氯化膽堿。A組活力降低，這可能與溫度增高，雞對(duì)能量的需求少，脂肪分解減少，便造成機(jī)體脂肪沉積。

表7 脂蛋白酯酶（LPL）活力 （U／L）

3．2．3 病理學(xué)觀察 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，B組肝臟呈土黃色且有明顯出血點(diǎn)，有些地方出現(xiàn)凝血塊，其他癥狀與第45天相似。C組和D組在給藥30d，與同期B組相比，明顯紅潤，外觀基本正常。組織學(xué)觀察到，給藥30d后，對(duì)照A組肝臟出現(xiàn)了少量空泡，且整個(gè)結(jié)構(gòu)不呈正常的放射狀排列，說明在高溫季節(jié)，日糧沉積也可造成一定程度肝變性，脂質(zhì)含量增多。B組細(xì)胞間界限消失，整個(gè)視野下只見脂肪空泡，脂肪顆粒彌漫性浸潤，肝細(xì)胞邊緣只有少量細(xì)胞質(zhì)，肝細(xì)胞索和肝竇結(jié)構(gòu)消失，整個(gè)肝臟成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。C組和D組肝臟未見肝細(xì)胞空泡，肝細(xì)胞大小、形狀、排列及肝竇大小均表現(xiàn)正常，與第45天時(shí)相比，肝細(xì)胞變性程度明顯減輕。

4 討論

4．1 蛋雞脂肪肝綜合征病理模型的建立 當(dāng)肝脂逐漸增加時(shí)，肝細(xì)胞機(jī)能降低，細(xì)胞膜破壞受損，致使高能低蛋白飼料的能量不能正常轉(zhuǎn)化，甘油三酯在肝臟蓄積，肝臟受損，高產(chǎn)期的蛋雞合成雞蛋時(shí)，加重肝臟的代謝功能，肝臟超負(fù)荷工作，也是造成肝臟受損變性的原因之一［3］。本試驗(yàn)中，第45天，B、C、D組ALT、AST活力明顯高于A組。顯微鏡下觀察脂肪滴充滿細(xì)胞致使肝細(xì)胞腫大變性，界限模糊，低倍鏡下每個(gè)視野有三分之一的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性或中倍鏡下每個(gè)視野有二分之一的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。曹華斌［4］等均采用高脂飼料喂飼試驗(yàn)動(dòng)物，與空白對(duì)照組相比，脂肪肝模型組肝指數(shù)、脂質(zhì)含量均高于空白對(duì)照組。表明高能低蛋白飼料能成功建立動(dòng)物脂肪肝模型。

4．2 殼聚糖復(fù)方制劑對(duì)雞脂肪肝綜合征的療效試驗(yàn)

Ormrod等［5］對(duì)缺乏載脂蛋白E的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠飼喂含有5%食用殼聚糖的飼料20周后，發(fā)現(xiàn)殼聚糖能顯著降低血清膽固醇。殼聚糖對(duì)脂肪肝的作用機(jī)理可能與其正電性有關(guān)，正電性的殼聚糖和負(fù)電性的膽汁酸結(jié)合排出體外，脂肪不被乳化，影響脂肪的消化吸收，降低血清甘油三酯含量，同時(shí)由于殼聚糖與膽汁酸結(jié)合排出體外，重新吸收入肝臟中的膽汁減少膽囊排空，而膽囊中必須有一定量的膽汁酸儲(chǔ)備，這就促進(jìn)肝臟將膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸，使血液膽固醇含量降低［6］；堿性的殼聚糖在胃中能與胃酸作用形成凝膠，在腸內(nèi)pH值條件下可以保持該凝膠不分解，且具有吸附膽汁酸和膽固醇的作用。吸附了膽汁酸和膽固醇的殼聚糖凝膠隨著糞便排出體外，從而降低了血中的脂肪和膽固醇，減少了脂肪的吸收，因而降低了血清總膽固醇和甘油三酯的水平［7］。

中藥柴胡皂苷可以有效地穩(wěn)定肝細(xì)胞膜系統(tǒng)，具有鎮(zhèn)靜止痛，解熱，抗病毒，抗炎，抗癌，降血脂，保肝，提高免疫力的作用。黃芩化學(xué)成分主要含有黃酮類成分，具有抗氧化功能，清除機(jī)體由于受損或衰老產(chǎn)生的自由基，對(duì)肝臟和心血管都有保護(hù)作用。大黃可以排除微循環(huán)障礙，恢復(fù)組織細(xì)胞的代謝功能及血液的供應(yīng)，增強(qiáng)肝細(xì)胞再生能力。Ahmed和Fuhrman均發(fā)現(xiàn)，生姜可以調(diào)節(jié)大鼠脂質(zhì)過氧化和氧化度，降低體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物［8］。其機(jī)理可能與上述藥物在降脂同時(shí)，兼以保肝、改善微循環(huán)、減輕脂質(zhì)過氧化等，從不同的環(huán)節(jié)作用于肝臟而產(chǎn)生的互補(bǔ)作用有關(guān)。本試驗(yàn)表明，殼聚糖復(fù)方制劑可明顯降低LPL活性，LDH活力升高，減輕了肝臟的炎性損傷和脂肪變性程度。綜上所述，通過添加殼聚糖復(fù)方制劑，對(duì)動(dòng)物脂肪肝有一定的治療效果。

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