徐 琪，陳 陽，黃正洋，張 揚，李欣玉，甑 霆，李 秀，段修軍，陳國宏

（1．江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室，江蘇 揚州225009；2．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌330045；3．國家水禽種質(zhì)資源基因庫，江蘇 泰州225300）

DNA甲基化是真核細胞基因組主要表觀遺傳修飾方式之一，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段，在基因表達調(diào)控、細胞分化、腫瘤發(fā)生、染色質(zhì)變構(gòu)、轉(zhuǎn)座子失活、基因沉默等生物過程中起著重要作用［1］。近年來，DNA甲基化研究取得了突飛猛進的進展，目前已深入到生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等各個領(lǐng)域。但越來越多的研究表明，人們更為關(guān)注的是某一個或某幾個特定基因DNA甲基化研究［2－4］，而從全基因組的研究較少，在畜禽僅見豬、雞上見有報道［5－6］。

DNA甲基化不僅影響到基因的表達，還會影響到性狀的表達［7－8］。目前已知，DNA甲基化與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，甲基化狀態(tài)的改變是致病作用的一個關(guān)鍵因素，它包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化程度的異常升高，這將導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定（如染色體的不穩(wěn)定、可移動遺傳因子的激活、易感基因的表達）。本試驗以金定鴨、櫻桃谷北京鴨、番鴨、半番鴨（番鴨♂×金定鴨♀、番鴨♂×櫻桃谷北京鴨♀）為試驗材料，應(yīng)用Methyl－Flash整體甲基化定量試劑盒檢測金定鴨、櫻桃谷北京鴨與番鴨及其雜交后代基因組甲基化程度的差異，并分析基因組整體甲基化水平與免疫性狀的關(guān)系，以期探明半番鴨及其親本基因組整體DNA甲基化對部分免疫性狀的影響。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 試驗鴨均由國家水禽種質(zhì)資源基因庫（江蘇泰州）提供，隨機選擇同批出雛，健康的金定鴨、櫻桃谷北京鴨、番鴨、金番鴨（番鴨♂×金定鴨♀）、櫻番鴨（番鴨♂×櫻桃谷北京鴨♀），各20只，飼養(yǎng)管理條件相同，按正常免疫程序免疫。10周齡時，采集EDTA抗凝血5mL，其中3mL用于淋巴細胞分離，2mL用于血清分離。

1．2 免疫指標的測定 分離后血清，按照全自動生化分析儀（日立7170A型）及試劑盒使用說明書（上海北加生化試劑有限公司）進行免疫指標的測定，總蛋白、球蛋白采用終點法，IgA、IgM、IgG采用免疫透射比濁法。

1．3 外周血淋巴細胞的分離與DNA提取 利用淋巴細胞分離液（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），采用密度梯度離心法（Ficoll）分離外周血單核細胞（PBMCs），采用細胞基因組DNA快速抽提試劑盒（上海華舜生物技術(shù)有限公司）提取分離細胞的DNA。

1．4 DNA整體甲基化水平檢測 采用 Methyl－Flash整體甲基化定量試劑盒（Epigentek公司，美國）檢測，操作步驟按試劑盒說明書進行，酶標儀上450nm處讀取吸光度值，計算DNA甲基化水平。

1．5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS11．5軟件進行統(tǒng)計分析，組間顯著性檢驗采用麥角新堿（LSD）法多重比較，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2．1 DNA整體甲基化水平檢測結(jié)果 5個鴨群體DNA整體甲基化水平檢測結(jié)果見表1。兩個遠緣雜交種（番鴨♂×金定鴨♀、番鴨♂×櫻桃谷北京鴨♀）的DNA整體甲基化程度顯著高于或極顯著高于親本（金定鴨、櫻桃谷北京鴨、番鴨），而3個親本間以及兩個遠緣雜交種間差異不顯著（P＞0．05）。

表1 5個鴨群體DNA整體甲基化水平

2．2 鴨免疫性狀測定結(jié)果 對金定鴨、櫻桃谷北京鴨、番鴨、金番鴨和櫻番鴨的總蛋白、球蛋白、IgA、IgM和IgG部分免疫性狀進行測定，結(jié)果見表2。

表2 5個鴨群體部分免疫性狀的測定結(jié)果 ±SD）

表2 5個鴨群體部分免疫性狀的測定結(jié)果 ±SD）

群體 n 總蛋白（g／L） 球蛋白（g／L） IgA（g／L） IgM（g／L） IgG（g／L）金定鴨 20 49．05±3．00a 29．17±2．28a 0．17±0．05ab 0．24±0．10ac 0．30±0．09a櫻桃谷北京鴨 20 47．38±8．97ac 29．10±6．44a 0．20±0．07a 0．25±0．13a 0．16±0．06b番鴨 20 45．42±2．83bc 26．44±2．06b 0．15±0．10b 0．21±0．10aef 0．12±0．06c番鴨♂×金定鴨♀ 20 42．60±4．83bd 23．98±3．18c 0．14±0．03b 0．16±0．05be 0．07±0．02d番鴨♂×櫻桃谷北京鴨♀ 20 39．98±3．71d 22．67±2．37c 0．14±0．03b 0．17±0．07bcf 0．07±0．02cde

由表2可以看出，所有免疫指標大致表現(xiàn)為家鴨高于番鴨，番鴨高于半番鴨；除IgG外，金定鴨與櫻桃谷北京鴨其他4項免疫指標間差異不顯著（P＞0．05）；兩種半番鴨間5項免疫指標間差異不顯著（P＞0．05），且絕大多數(shù)性狀均顯著低于金定鴨和櫻桃谷北京鴨（P＜0．05）。

2．3 鴨基因組整體DNA甲基化水平與部分免疫性狀的關(guān)系 鴨基因組整體DNA甲基化程度與部分免疫性狀相關(guān)性統(tǒng)計結(jié)果見表3和圖1～5。

由表3和圖1～5可以看出，鴨基因組整體DNA甲基化水平與免疫性狀間呈負相關(guān)，其中與總蛋白、球蛋白和IgM相關(guān)達顯著或極顯著水平。

表3 鴨DNA整體甲基化水平與部分免疫性狀的關(guān)系

圖1 鴨DNA整體甲基化水平與總蛋白關(guān)系

圖2 鴨DNA整體甲基化水平與球蛋白關(guān)系

圖3 鴨DNA整體甲基化水平與IgA關(guān)系

圖4 鴨DNA整體甲基化水平與IgM關(guān)系

圖5 鴨DNA整體甲基化水平與IgG關(guān)系

3 討論

本試驗采用比色法，利用MethylFlash甲基化DNA定量試劑盒檢測了鴨全基因組的5－mC，該方法能高度特異的識別5－mC，而不會與未甲基化的胞嘧啶結(jié)合，與基于套色板的方法相比（比如高效液相色譜儀（HPLC）或者質(zhì)譜）相比，結(jié)果更精確可靠，也更穩(wěn)定。本試驗發(fā)現(xiàn)半番鴨及其親本的基因組甲基化從1．2%到2．1%不等。一般認為在脊椎動物基因組中有3%的C是甲基化的，也有人認為在脊椎動物基因組內(nèi)相鄰的二核苷酸CpG的含量為20%，而CpG中70%的C是甲基化的，即1．4%的C是甲基化［9］，這與本試驗結(jié)果是一致的。當(dāng)然，基因組甲基化程度還與所檢測的組織與細胞有關(guān)系，梁秋菊等人［10］研究發(fā)現(xiàn)，在豬肌肉基因組甲基化要顯著高于血液DNA甲基化含量，本試驗主要對外周血淋巴細胞基因組甲基化進行了檢測，而淋巴細胞包含有T細胞、B細胞和NK細胞等多種細胞［11］，這可能多少對試驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。本試驗發(fā)現(xiàn)半番鴨的甲基化含量高于親本，而免疫性狀表型值卻低于親本，這表明在雜種形成過程中某些位點發(fā)生了甲基化作用，或者說雜種利用甲基化關(guān)閉了一些抗性基因的有效表達。試驗研究證實，雜種將兩個不同的基因群組合在一起形成的不同于親本的新的遺傳體系，新的遺傳體系不僅僅是所得遺傳物質(zhì)的簡單組合，而是經(jīng)歷了復(fù)雜的調(diào)整過程，產(chǎn)生了一種不同于親本的遺傳與表觀遺傳信息。在新的體系中，親本的基因型彼此協(xié)調(diào)、相互促進、有效地控制基因的表達，雜種在新的遺傳體系中產(chǎn)生了不同于親本品種的性狀表現(xiàn)，這也就是半番鴨免疫性狀表型值普遍低于親本主要原因。本試驗還發(fā)現(xiàn)鴨基因組整體DNA甲基化水平與免疫性狀間呈負相關(guān)，這主要是由于DNA甲基化程度越高，基因表達受到抑制，其表型值也相應(yīng)較低。

［1］ Trygve O Tollefsbol．Epigenetics Protocols［M］．Totowa New Jersey：Humana Press，2004．

［2］ Ying Yu，Huanmin Zhang，F(xiàn)ei Tian，etal，Quantitative Evaluation of DNA Methylation Patterns for ALVE and TVB Genes in a Neoplastic Disease Susceptible and Resistant Chicken Model［J］．PLoS ONE，2008，3（3）：1－10．

［3］ Luo Juan，Yu Ying，Zhang Huanmin，etal．Down－regulation of Promoter Methylation Level of CD4gene after MDV Infection in MD－susception Chicken line［J］．BioMed Central（BMC）Genetics，2010，（5）：25－31．

［4］ 劉振山，李齊發(fā)，張慶波，等．犏牛及其親本JGF2基因mRNA表達水平、DNA甲基化狀態(tài)差異分析［J］．自然科學(xué)進展，2009，19（4）：380－385．

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［8］ 蔣曹德，鄧昌彥，熊遠著．豬個體DNA甲基化百分差異與胴體性狀的關(guān)系［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2005，13（2）：179－185．

［9］ 徐青，余云舟，趙萌，等．DNA甲基化在動植物遺傳育種中的研究進展［J］．生物技術(shù)通訊，2011，22（1）：113－117．

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［11］楊漢春．動物免疫學(xué)［M］．2版，北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003．